[发明专利]一种吕宋肽菌素C的制备方法

说明书

本发明公开了一种吕宋肽菌素C的制备方法，属于生物制药领域。所述制备方法为：以吕宋马杜拉放线菌DSM43766为出发菌，通过基因失活技术使乙酰化酶基因luz27失活，所述乙酰化酶基因luz27的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。然后将构建的吕宋马杜拉放线菌突变菌株接种于发酵培养基中，发酵培养，发酵产物经分离纯化制得所述吕宋肽菌素C。本发明通过基因工程手段对吕宋马杜拉放线菌的乙酰化酶基因luz27进行失活，阻断其吕宋肽菌素C的乙酰化修饰过程，从而特定地积累具有较高生物活性的组分吕宋肽菌素C。通过微生物发酵方法，专一性生产吕宋肽菌素C，该方法绿色、经济、高效，具有工业生产前景。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种绿色、高效和专一性制备抗病毒活性分子吕宋肽菌素C的方法。

背景技术

吕宋肽菌素(luzopeptin)是由吕宋马杜拉放线菌(Actinomadura sp.DSM43766)产生的一类双嵌入家族非核糖体肽类化合物。该菌种于1980年由日本科学家在菲律宾吕宋岛的土壤样品中分离得到。吕宋肽菌素具有良好的抗肿瘤活性和抗菌活性，同时是高效的HIV逆转录酶抑制剂。

吕宋马杜拉放线菌在不同发酵条件下可以产生A、B、C等多种组分。吕宋肽菌素A～C的结构通式如式(Ⅰ)，

吕宋肽菌素A:R₁＝R₂＝CH₃CO；吕宋肽菌素B:R₁＝H,R₂＝CH₃CO；吕宋肽菌素C:R₁＝R₂＝H。

吕宋肽菌素C含有两个4-羟基-2,3,4,5-四氢哒嗪-3-羧酸结构单元，其中4位羟基可以发生乙酰化修饰。吕宋肽菌素A和吕宋肽菌素B分别是吕宋肽菌素C的双乙酰化物和单乙酰化物。这三种组分中吕宋肽菌素C的水溶性最好，跨膜能力最强，更重要的是，吕宋肽菌素C的HIV逆转录酶活性也最强，抑制HIV-1和HIV-2的逆转录酶的IC₅₀分别小于7nM和68nM，且吕宋肽菌素C对HIV宿主细胞无明显毒性。

然而，吕宋马杜拉放线菌的原始出发菌株在不同培养条件下，或不产生吕宋肽菌素C，或与其他组分共存，产量较低，且受其他组分影响分离纯化困难。

同时，吕宋肽菌素C化学合成非常困难。Dale L.Boger和Delphine Valognes分别在1999年和2001年报道了吕宋肽菌素C的全合成。但由于吕宋肽菌素C结构复杂，两种全合成路线都需要约20步，成本高而收率低。

因此，开发一种低成本且高效的制备吕宋肽菌素C的方法是本领域技术人员需要解决的问题。在微生物育种工作中，通过特定基因失活或高表达来改变代谢产物的种类或产量得到了广泛的应用。通过基因工程手段改造吕宋马杜拉放线菌使其能够专一性生产吕宋肽菌素C将是一种可行方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种经微生物发酵，绿色高效制备吕宋肽菌素C的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

对吕宋马杜拉放线菌(Actinomadura sp.DSM43766)进行全基因组测序，鉴定吕宋肽菌素的生物合成基因簇，该基因簇中有5个参与氨基酸合成及后修饰相关基因，其中有个编码乙酰化酶的基因luz27，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过基因敲除或基因失活等策略实现对该基因功能的破坏，以阻断吕宋肽菌素C的乙酰化修饰，进而实现吕宋肽菌素C组分的积累。

本发明提供了一种吕宋马杜拉放线菌突变菌株，其构建方法包括：以吕宋马杜拉放线菌DSM43766为出发菌，通过基因失活技术使乙酰化酶基因luz27失活，所述乙酰化酶基因luz27的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。