[发明专利]一种金线莲多倍体诱导方法

说明书

本发明提供一种金线莲多倍体诱导方法，采用诱导剂准备，茎段预培养处理、诱导剂浸泡处理、筛选培养等步骤。本发明使得染色体加倍诱导效率更高，有效改良了秋水仙素诱导导致的外植体低成活率现象，低浓度诱导剂的使用不仅可以使植株更加健康高效的生长，也可以降低对操作人员的身体伤害。

技术领域

本发明涉及园艺植物繁殖与新品种培育领域，特别涉及一种金线莲多倍体诱导方法。

背景技术

金线莲的新品种获取多是直接取于户外野生株系，外植体消毒后进行组培苗的增殖扩繁。通过杂交获取新品种的方式较少。在金线莲的多倍体育种中，多采用秋水仙素进行诱导使植株染色体加倍，从而获取多倍体植株。如 0.1%秋水仙素溶液浸泡处理金线莲茎段48 h，其诱变率可达48%。活体条件下用一定浓度的氨磺灵（Oryzalin）诱导加倍，主要采用浸渍、滴液、涂抹、套罩、注射或毛细管法等处理。离体条件下用Oryzalin诱导加倍，主要采用浸泡或包埋法。已经在毛新杨、百合、苹果、大蒜、烟草、大丁草、单倍体苹果、单倍体洋葱、单倍体梨、百合等植物上进行了尝试，并获得成功加倍。在金线莲上还未进行试验。

目前金线莲杂交育种的研究很少，金线莲不同品种间存在着较明显的杂交不亲和问题，且种荚多为败育，自然条件下种子的萌发率与成活率低，很难得到杂交后代，更难获得多倍体植株。

通过人工诱导多倍体，大多是用化学诱导法，秋水仙碱是目前应用较多的染色体加倍试剂。秋水仙碱应用虽然广泛，但是其与植物微管蛋白作用时亲和力较低、不易作用于分生组织细胞，且清除困难，会导致被处理的植物材料容易被毒害、危害实验操作人员。此外，植物材料上残留的秋水仙碱可能导致产生额外染色体加倍，被加倍的细胞可以被重复加倍，这就会引起含有不同倍数水平的染色体的植株出现。Oryzalin是一种抗微管物质，能与植物微管蛋白高度亲和形成Oryzalin－微管蛋白复合体，并干扰细胞器的Ca²⁺运输系统，导致更多微管解聚合，抑制细胞有丝分裂，达到低浓度、高效率诱导细胞染色体加倍的效果。与秋水仙素相比较，Oryzalin具有低浓度、低毒性、低成本、高效率诱导染色体加倍等特点。

目前利用Oryzalin诱导多倍体这一技术已成功地应用于多种药用植物的育种，获得了许多新的种质资源，而有关Oryzalin诱导金线莲多倍体的研究国内外尚未见报道。采用组织培养技术和Oryzalin诱导处理相结合方法，开展在离体培养的条件下诱导金线莲多倍体的研究，以期探索一条经济、简便、有效的多倍体金线莲诱导途径，为金线莲的良种培育奠定技术基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金线莲多倍体诱导方法。解决目前金线莲杂交育种的研究很少，金线莲不同品种间存在着较明显的杂交不亲和问题，且种荚多为败育，自然条件下种子的萌发率与成活率低，很难得到杂交后代，更难获得多倍体植株等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）诱导剂准备：先将20 mg氨磺灵粉末溶于1 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配制浓度为2% 的母液，用纯净水稀释浓度为0.002% 的氨磺灵溶液，冻融灭菌处理后密封于4摄氏度冰箱保存。

（2） 茎段预培养处理：选取长势一致、生长健壮的无菌试管苗，在超净工作台中切成3-4 cm的带有多个芽点的茎段，接入MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+0.5g/L AC +30g/L 蔗糖的培养基中，预培养2-3天，至茎段的侧芽部位出现肉眼可见白色芽点。

（3）诱导剂浸泡处理：将已长出芽的长茎段浸泡于0.002% 氨磺灵溶液中，置于23摄氏度、12小时光照条件下，浸泡处理108h，每6小时摇晃一次，使材料与药液充分接触。浸泡结束后，用无菌水冲洗茎段3-5次，切成1-1.5cm带单个芽的小段，接入增殖培养基 MS+2mg/L 6-BA+ 0.5mg/L NAA+ 0.5g/L AC + 30g/L 蔗糖上，在温度23±2℃、光照强度2000-3000lx、光照时间12h/d条件下进行培养。以上操作均在无菌条件下进行。