[发明专利]基于效率的qPCR初始浓度检测的高鲁棒性六参数全局拟合法

说明书

本发明涉及一种基于效率的qPCR初始浓度检测的高鲁棒性六参数全局拟合法。本发明通过化学反应的原理与推导，给出了荧光值和效率值变化规律的六参数数学模型。以均方差函数作为误差函数，对实验数据值进行全局拟合的最优化求解。通过对效率值进行线性放缩，消除机器检测线的设定和检测灵敏度的影响，提高算法的鲁棒性与通用性。通过修正的荧光值和效率值进行反推，获取准确的初始荧光值，并利用已知的荧光值和浓度关系曲线或数据对，通过比对或等比计算求得初始浓度值。

技术领域

本发明涉及实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)领域，具体涉及一种利用实时荧光定量聚合酶链式反应对核酸样本初始浓度进行绝对或相对定量的方法。

背景技术

实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)是一种通过聚合酶链式反应扩增核酸样本，并通过荧光实时反映核酸分子数量的技术。qPCR技术被广泛应用于核酸样本的定量，是核酸定量分析中最重要的工具。

目前利用实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)进行核酸定量的主流方法是循环阈值法(Ct法)。该方法为核酸样本经qPCR扩增得到的扩增曲线(纵坐标为荧光量，横坐标为循环数)设定一个统一的荧光阈值，依据该荧光阈值求出各扩增曲线所对应的分数循环阈值(Ct)。由聚合酶链式反应的指数扩增机理，Ct值与样本初始浓度的对数呈线性关系，从而可以通过已知浓度样本的一系列稀释实验建立起Ct值与初始浓度的关系曲线，即标准曲线。这样，只要有未知浓度的样本的Ct值，即可在标准曲线上找到对应的初始浓度。该方法的不足是实际实验不完全符合聚合酶链式反应理论上的指数扩增机理；未知样本的扩增效率与已知样本的扩增效率不同，导致得到的样本初始浓度不准确；需要建立标准曲线，较为繁琐；只利用了指数扩增区的数据，忽视了指数区以外的数据中所蕴含的信息。

另一个重要的方法是S形曲线拟合法(SCF)。该方法认为聚合酶链式反应的扩增曲线符合逻辑斯蒂增长规律，对核酸样本的qPCR扩增曲线进行S形曲线(逻辑斯蒂曲线)拟合。拟合后可以直接得到核酸样本的初始浓度(以荧光量为单位)，也有进一步求取Cy0，建立Cy0与样本浓度的标准曲线来求得样本浓度。该方法的不足是qPCR反应的逻辑斯蒂扩增机理缺少理论支持，拟合后直接求得的样本浓度不准确，对扩增曲线的后半部分拟合效果不好。

Ana C.Carr,Sean D.Moore于2012年在《Robust Quantification of PolymeraseChain Reactions Using Global Fitting》一文中提到了一种对qPCR扩增曲线进行全局拟合，进而求取核酸样本初始浓度的方法。该方法的拟合公式有较好的理论支持。其不足是鲁棒性不足，若将机器检出限以下的荧光数据纳入拟合，求得的样本浓度不准确。

发明内容

本发明的目的是：基于化学机理，利用效率放缩的方法，提出一种qPCR初始浓度检测的方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供了一种基于效率的qPCR初始浓度检测的高鲁棒性六参数全局拟合法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、建立六参数全局拟合的递推公式如下式(1)所示：

式(1)中，F_n表示第n次循环所获得的荧光值，a、b、c、d均为模型参数；

步骤2、设定背景荧光值为参数bg，设置最初荧光值为参数F₀，将包括参数bg、参数F₀、参数a、b、c、d在内的总计六个参数代入式(1)所示的递推公式，获取六参数的拟合结果序列；

步骤3、将拟合结果序列和机器获取的所有实验值进行比较，利用优化算法对式(1)所示的递推公式进行优化，最终获取参数bg、参数F₀、参数a、b、c、d的最优参数值；

步骤4、获取拟合后的效率变化趋势