[发明专利]一种多位点miRNA联合检测方法

权利要求书

1.一种多位点miRNA联合检测方法，包括以下步骤：

1)设计并合成5′端带有生物素标记的上游通用引物F和下游通用引物R；针对每个目的miRNA序列设计合成一对特异性单链DNA探针：探针A和探针B，与相对应的待检测miRNA片段进行杂交，形成多个杂化双链；

探针A：5′端开始依次为：上游通用引物序列——与miRNA的3′端8-14个碱基反向互补序列；

探针B：5′端开始依次为：磷酸化标记——与miRNA的5′端8-14个碱基反向互补序列——特异性tag序列——下游通用引物反向互补序列；

2)使用连接酶将步骤1)形成的杂化双链中的探针A和探针B连接；

3)使用通用引物对步骤2)中产生的连接产物进行扩增；

4)使用特异性磁珠对步骤3)产物片段进行杂交；

5)使用链霉亲和素标记的荧光染料对步骤4)产物进行荧光标记；

6)检测步骤5)产物荧光信号并进行数据分析。

2.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤1)中，进行杂交的条件为：80-90℃，2-5min，缓慢降至室温，保持2-4h。

3.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述连接酶选自T4 DNA连接酶或T4 RNA连接酶或SplintR DNA连接酶。

4.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤2)中，连接条件为：16-37℃，15-60min-过夜。

5.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤3)中，扩增反应条件为：预变性95℃2min，热循环95℃15s，50℃30s，72℃40s，25个循环，最后延伸72℃5min。

6.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述特异性磁珠耦联有特异性核酸序列，每种磁珠上带有不同的标记，可与特定的PCR产物结合。

7.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤4)中，进行杂交的条件为：85-100℃，60-120s；25-40℃，10-20min。

8.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤5)中，进行荧光标记的反应条件为：25-37℃，10-30min。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，还包括通过以下方法判断待测样本中是否还有目的miRNA：若检测值大于阴性对照检测值3倍，则待测样本中含有目的片段，否则为不含有目的片段。

10.根据权利要求1-8任意一项所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，还包括通过以下方法进行待测样本中miRNA定量：以10倍梯度稀释的已知浓度的目的片段标准品检测结果制作标准曲线，将待测样本检测结果带入公式，计算待测样本中目的miRNA片段的含量。