[发明专利]一种多位点miRNA联合检测方法

说明书

本发明公开了一种多位点miRNA联合检测方法，包括：1)针对每个目的miRNA序列设计合成一对特异性单链DNA探针，与相对应的待检测miRNA片段进行杂交，形成多个杂化双链；2)使用连接酶将步骤1)形成的杂化双链中的探针连接；3)使用通用引物对步骤2)中产生的连接产物进行扩增；4)使用特异性磁性微珠对步骤3)产物片段进行杂交；5)使用链霉亲和素标记的荧光染料对步骤4)产物进行荧光标记；6)检测步骤5)产物荧光信号并进行数据分析。本发明的方法无需进行逆转录，节省成本，降低损失；特异性好，可区分单个碱基；可实现多重检测，以及适用于各领域多位点miRNA的定量检测。

技术领域

本发明属于miRNA检测技术领域，涉及一种多位点miRNA联合检测方法。

背景技术

miRNA已经作为肝癌的血液学分子标志物加入《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》。该规范指出，目前基于循环miRNA模型的肝癌检测试剂盒已经由多家医院验证，并获得国家药物监督管理局三类医疗器械注册证，进入临床应用。

此外，在冰冻组织、福尔马林固定组织或石蜡包埋的临床组织样本中，miRNA也都表达出较高的稳定性，更进一步表明其作为诊断性分子标记物具有巨大潜能。但是由于miRNA本身碱基数过少，使得探针碱基序列的选择受限。并且不同miRNA具有不同的最适杂交温度，在相同的杂交条件下，往往会引起很大程度的错配杂交，从而限制了不同miRNA的高效识别。另外，miRNA序列还存在高度相似性，所以检测的特异性往往也难以保证。

目前常见的miRNA检测方法分为直接检测和间接检测两个类别。直接检测方法主要基于荧光、比色、电化学等方法，这些方法可以直接检测miRNA的水平和表达，但是灵敏度较低，且难以区分序列相近的同源miRNA。间接检测方法主要包括Northern Blot、微阵列芯片、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)等检测方法。其中Northern Blot和微阵列芯片方法敏感性较差，对起始miRNA量的需求也较大。相比之下，qRT-PCR是目前检测miRNA最灵敏、最有效的方法。

该方法虽然在一定程度上克服了大部分miRNA检测方法的缺陷，但是还存在着以下几点问题：首先，TaqMan探针虽然检测灵敏度较高，但是针对每种miRNA的设计不仅成本过高，技术上也很具有挑战性。其次，该方法不能在同一个反应孔进行miRNA的多重检测，而单miRNA位点的检测对于疾病诊断的敏感性和特异性相对较低。再加上该方法的检测成本较高，这些缺点都限制了该方法的广泛应用和对临床的转化。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种多位点miRNA联合检测方法。可应用于各领域多位点miRNA的定量检测，包括但不限于癌症筛查、疾病诊断、科学研究等。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种多位点miRNA联合检测方法，包括以下步骤：

1)设计并合成5′端带有生物素标记的上游通用引物和下游通用引物；针对每个目的miRNA序列设计合成一对特异性单链DNA探针：探针A和探针B，与相对应的待检测miRNA片段进行杂交，形成多个杂化双链；

探针A：5′端开始依次为：上游通用引物序列——与miRNA的3′端8-14个碱基反向互补序列；

探针B：5′端开始依次为：磷酸化标记——与miRNA的5′端8-14个碱基反向互补序列——特异性tag序列——下游通用引物反向互补序列；

2)使用连接酶将步骤1)形成的杂化双链中的探针A和探针B连接；

3)使用通用引物对步骤2)中产生的连接产物进行扩增；

4)使用特异性磁珠对步骤3)产物片段进行杂交；

5)使用链霉亲和素标记的荧光染料对步骤4)产物进行荧光标记；