[发明专利]一种海洋盐单胞菌胞外多糖在制备免疫增强剂中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及到一种海洋盐单胞菌胞外多糖的制备方法及其在制备免疫增强剂中的应用。从一株海洋盐单胞菌Halomonas sp.2E1的发酵液中分离纯化得到了一种胞外多糖(EPS2E1)，并对它进行了理化分析和体外免疫增强活性测定。结果表明，EPS2E1为一种甘露聚糖，能够通过激活MAPKs(ERK和JNK)和NF‑κB信号通路提高炎症因子(NO、IL‑6、IL‑1β和TNF‑α)和环氧化酶‑2(COX‑2)的表达，具有显著的免疫增强活性，且没有明显的细胞毒性。因此，本发明提供的海洋盐单胞菌胞外多糖EPS2E1可用于制备与免疫增强相关的药物或保健品，具有良好的开发利用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及到一种海洋盐单胞菌胞外多糖的制备方法及其在制备免疫增强剂中的用途。

背景技术

免疫系统的主要功能是识别和消灭病原体，以维持机体的生理平衡和稳定，但过强或过低的免疫力可引起多种不良的免疫反应。免疫缺陷是免疫功能低下的表现，其是导致感染和恶性肿瘤的主要因素之一。目前，治疗免疫缺陷最常见的方法是使用免疫增强剂，如真菌多糖、胸腺肽、干扰素和卡介苗。在这些药物中，多糖作为免疫增强剂被证明是安全无毒的。多糖能与巨噬细胞表面受体结合，激活信号转导通路，促进白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN)和一氧化氮(NO)等细胞因子的分泌，这些细胞因子作为细胞间相互作用的内源性信号继续诱导其他细胞因子的产生，并在调节免疫应答中发挥重要作用。

海洋生物的多样性远远超过陆地生物，尤其海洋微生物种类繁多。由于低温、高盐、高压和寡营养的极端海洋环境，海洋微生物的代谢产物往往表现出新颖的遗传或生理特征和广泛的生物活性。在所有的代谢产物中，胞外多糖可以提高微生物生长和代谢过程中对环境的适应性。近年来，从海底热液喷口和冷泉区域发现的海洋细菌中分离出了大量具有多种特性的胞外多糖，其中一些表现出良好的免疫刺激活性，具有潜在的药物开发价值。因此，海洋微生物胞外多糖备受人们的关注。

本发明从一株海洋盐单胞菌(Halomonas sp.2E1)中分离纯化得到一种胞外多糖(EPS2E1)，同时对其性质进行了分析。鉴于海洋多糖广泛的生物活性，我们利用RAW 264.7巨噬细胞模型评价了EPS2E1的体外免疫增强活性，并阐明了其活性的作用机制。本发明首次发现从海洋盐单胞菌发酵物中纯化获得的胞外多糖EPS2E1具有显著的免疫增强活性，为开发海洋多糖类免疫增强剂和保健品奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋盐单胞菌胞外多糖在制备免疫增强剂、或药物组合物、或保健品中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种海洋盐单胞菌来源于中国南海(119°17′04.956″E,22°06′58.384″N,水深1142米)盐单胞菌Halomonas sp.2E1，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2020年10月29日，保藏编号：CGMCC NO.20969。

所述海洋盐单胞菌胞外多糖优选以下方法制备：将海洋盐单胞菌Halomonassp.2E1按0.1～1％接种于2216E培养基(0.1～1％蛋白胨、0.1～0.2％酵母浸粉、0.5～2％蔗糖和陈海水)中，置于摇床上震荡培养(25～40℃、100～200rpm、24～48h)；发酵完毕后将发酵液离心(4000～8000rpm、5～30min)去除菌体，收集上清液，加入2～4倍体积的95％乙醇溶液，离心收集沉淀，加适量蒸馏水复溶后透析，冻干(-60～-80℃，24～48h)得到粗胞外多糖；采用DEAE Fast Flow离子交换柱层析对粗多糖进行纯化(先用蒸馏水洗脱1～3个柱体积，再用0～2mol/L氯化钠溶液洗脱8～12个柱体积)，得到的纯化组份进行透析、冻干，继续采用Sephadex G75凝胶柱层析进行纯化(流动相为蒸馏水或0.1～1mol/L碳酸氢铵溶液)，最终得到纯化的胞外多糖，即为EPS2E1。