[发明专利]液质联用快速测定尿液或细胞培养基中稻曲菌素A含量的方法

说明书

本发明属于分析化学领域，具体公开了液质联用快速测定尿液或细胞培养基中稻曲菌素A含量的方法，包括如下步骤：（1）样品预处理；（2）色谱‑质谱检测。本发明针对尿液及培养基样品中UA残留分析问题，采用HLB柱净化去除无机盐、非极性或碱性小分子等共存组分后，低比例甲醇水洗脱液再经过WAX柱富集净化，最终借助超高效液相色谱‑三重四级杆质谱联用技术成功消除样品检测时的基质效应，首次实现尿液及培养基中UA的高灵敏检测。该方法具有重新性好、灵敏度低等优点，稻曲菌素A的定量限低至50 ng/L，可以满足对尿液及细胞培养基中稻曲菌素的定量检测要求。

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种尿液或细胞培养基中稻曲菌素A的检测方法。

背景技术

真菌毒素是一类由真菌产生的具有生物活性的次生代谢产物，在多种环境和生物介质中频繁检出，常被我国和欧洲食品安全局、世界卫生组织和美国食品药品监督局等国际组织及机构列为优先控制污染物。近年来，由于稻曲病(Rice False Smut)在美洲、亚洲和欧洲等水稻主产区的大面积爆发，其主要次生代谢产物-稻曲菌素(Ustiloxins)受到广泛关注。研究发现，稻曲菌素是一类有效的微管蛋白聚合抑制剂，能抑制细胞增殖甚至导致细胞凋亡，且可引起家禽肝、肾等器官病变，甚至个体死亡。水溶性稻曲菌素在水稻生长过程中很容易从稻曲球中直接迁移到稻田地表水、土壤等稻田介质中，还存在向水稻植株特别是稻谷中迁移并蓄积的隐患。作为全球水稻生产和消费的主要国家，我国可能存在大量的稻曲菌素暴露人群。目前，关于稻曲菌素在生物体内的富集情况仍是一片空白。选择性监测尿液及细胞培养基中稻曲菌素的残留情况对开展稻曲菌素在生物体如人、小鼠、细胞等中的吸收、代谢及排除动力学至关重要。因此，开发尿液或细胞培养基中稻曲菌素的分析方法对开展人体暴露水平及暴露风险评估具有重要意义。

稻曲菌素A(Ustiloxin A，UA)是现有已鉴别的6种稻曲菌素中最具代表性和毒性最强的毒素(占总量80％以上)。液相色谱-质谱联用分析法(LC-MS)由于分析技术具有高灵敏度高、高特异性等特点，目前在真菌毒素的研究等领域广受关注。虽然已有关于稻曲菌素的文献报道，但均集中在发病稻谷或稻曲球等基质干扰相对简单且含量较高的样品的含量分析。目前，针对尿液、细胞培养基等基质中稻曲菌素的残留分析尚未见报道。尿液样本成分相对复杂，含高浓度潜在干扰物质，例如钠、钾等无机离子，柠檬酸、阿魏酸、二甲基戊酸等有机弱酸、磷酸胆碱、马尿酸、氨基酸等大极性两性化合物。常规细胞培养基中也含有维生素、氨基酸、无机盐、蛋白质等易造成基质效应的干扰物。采用液质联用技术分析上述样品中大极性有机弱酸或弱碱化合物时，基质效应尤其突出，往往要求高倍数稀释待测样品提取液。因此，现有文献报道的分析方法无法实现尿液及培养基中UA的高灵敏度检测。

发明内容

针对现有的技术问题，本发明旨在提供一种液质联用测定尿液样本及细胞培养基中稻曲菌素A的方法，待测样品通过合适的前处理后消除有机酸、无机盐及蛋白质等杂质在的基质抑制效应，实现样品中UA的快速、准确、高灵敏检测。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

尿液或细胞培养基中稻曲菌素A的液质联用检测方法，包括下述步骤：

(1)样品预处理：

(a)量取尿液或细胞培养基样本，加入等体积二氯甲烷溶液涡旋，高速离心，保留上清液待净化；

(b)用含0.1％-5％(体积分数)甲酸的0.2M乙酸铵溶液稀释步骤(a)的待净化液，待净化液与乙酸铵溶液的比例为1:1～1:5(V/V)，稀释后的待净化液通过提前活化的HLB小柱，小柱用0-4mL含体积分数为0.1-0.5％甲酸的0.05-0.5M乙酸铵溶液淋洗一次，弃去淋洗液；真空泵抽干；然后采用2-4mL 20-90％甲醇-水溶液洗脱，收集洗脱液；

HLB柱活化条件为：依次量取1-4mL甲醇、1-4mL含有0.1％-5％(体积分数)甲酸的0.05-0.5M乙酸铵溶液缓冲液通过HLB柱；