[发明专利]一种表达荧光素酶的VRE及其用途

说明书

本发明涉及一种基因修饰的自发荧光的耐万古霉素肠球菌(Vancomycin‑Resistant Enterococcus,VRE)及其应用。本发明利用质粒构建和电转化技术，构建了能够在肠球菌中表达的含有荧光素酶基因簇(luciferase gene cassette,lux)的质粒，该质粒经电转化导入VRE，经自发荧光鉴定与培养特性的观察,最终获得了可稳定表达荧光素酶的VRE，该VRE能够在体内和体外检测。本发明为研究VRE相关疾病进展，筛选合适的杀菌方法、抗生素等提供重要的可视化研究工具。

技术领域

本发明涉及微生物医药领域，具体涉及一种含有荧光素酶基因的质粒和稳定表达荧光素酶的耐万古霉素的肠球菌(Vancomycin-Resistant Enterococcus，VRE)的构建方法，该方法构建获得的菌株，以及该菌株在筛选杀菌方法或者筛选药物以及制备感染动物模型等方面的用途。

背景技术

在人类的病原体中，粪肠球菌(E.faecalis)是婴儿胃肠道主要的革兰氏阳性菌，并长期定植于成年人的胃肠道中。粪肠球菌是核心微生物群的主要成员之一，可在免疫功能低下的宿主或具有潜在健康状况的宿主中引起机会性疾病。

随着抗生素的广泛应用，多重耐药性肠球菌(multidrugresistant，MDR)已成为导致院内感染的重要原因。根据美国疾病控制和预防中心在2019年发布的《抗生素耐药威胁报告(2019年)》，耐万古霉素的肠球菌(Vancomycin-Resistant Enterococcus，VRE)被列为严重抗生素耐药威胁之一。粪肠球菌中，VRE可达三分之一，当感染VRE时，患者的病死率可达到10％。

临床上，VRE感染主要用采用单一或联合抗生素进行治疗。据报道，替加环素在复杂的腹腔内或皮肤/软组织感染中对某些VRE具有灭菌作用。此外，美国传染病学会(IDSA)在2009年发布的指南特别建议使用利奈唑胺和喹奴普汀/达福普汀治疗VRE感染。然而，有研究发现，尽管达到抗生素停药的条件，VRE在胃肠道定植后，仍可以高密度持续数月。最近，许多研究报道VRE可通过粪便移植被有效清除，但细菌清除的机制尚不清楚。

因此迫切需要对VRE定植和治疗的机制进行分析，从而需要构建体外和体内研究的模型。生物发光是生物体内在酶的作用下发光的现象。生物发光现象广泛存在细菌、昆虫等生物体中。利用萤光素酶基因(luciferas gene cassette，LUX)基因标记细胞的生物发光技术具有操作简便、结果直观、不依赖底物、对机体损伤小等优点。该技术已广泛应用于肿瘤生长监测和转移示踪、基因治疗、目标基因表达的检测等多个领域。

发明内容

本发明构建包含萤光素酶基因LUX A/B/C/D/E基因簇的质粒，该质粒可以在大肠杆菌中完成构建过程，其启动子能够被VRE识别。通过电转化，将该质粒转化至VRE中，筛选表达荧光素酶的VRE，并将其应用于选择合适的杀菌方法或药物以及制备感染动物模型等方面。因此，

本发明提供一种质粒，所述质粒包括荧光素酶基因簇LUX A/B/C/D/E，该质粒能够在VRE中启动LUX A/B/C/D/E基因的表达，质粒为可用于革兰氏阳性菌的质粒。

优选的，所述质粒包括能在革兰氏阳性菌表达的氯霉素耐药基因，可用于转化成功菌株的筛选。

更优选的，起始质粒为pNZ8148，该质粒能在革兰氏阳性菌中复制并表达基因。

本发明还提供一种基因修饰的耐万古霉素的肠球菌(Vancomycin-ResistantEnterococcus，VRE)，所述VRE能稳定表达荧光素酶。

本发明还提供一种上述基因修饰的VRE的构建方法，所述构建方法包括：

(1)制备上述包含LUX A/B/C/D/E基因簇的质粒。

(2)制备电转化感受态VRE；