[发明专利]外源基因可控表达的腺病毒包装方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种外源基因可控表达的腺病毒包装载体。该方法所采用的腺病毒包装载体具有两个ITR片段及插入两个ITR片段之间的基因表达盒；所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子以及任选的目的基因；当有阻遏物存在时，所述阻遏型操作子能够阻遏其下游目的基因的表达。本发明创造性的将阻遏型操作子整合到腺病毒载体中，可以降低病毒包装过程中外源基因表达，从而排除外源基因的影响，提升特定病毒的产量。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种外源基因可控表达的腺病毒包装方法。

背景技术

病毒载体可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有高亲和性结合细胞表面受体，并传送其基因组进入某些类型细胞，进行感染的分子机制。广泛应用于基础研究、基因疗法或疫苗。

腺病毒特别适于用作病毒载体。腺病毒是无包膜病毒，直径约90nm～100nm，包含核衣壳和线性双链DNA基因组。病毒核衣壳包含五邻体衣壳体和六邻体衣壳体。一种独特的纤维与各五邻体基质相关，并且帮助病毒经由宿主细胞表面的柯萨奇病毒-腺病毒受体而附着到宿主细胞上。已识别出超过50种的腺病毒血清型菌株，其中大多数引起人类的呼吸道感染、结膜炎和胃肠炎。腺病毒通常作为宿主细胞核中的游离基因成分复制，而不是整合到宿主基因组中。腺病毒的基因组包含4个早期转录单位(E1、E2、E3和E4)，其主要具有调节功能，并为宿主细胞复制病毒作准备。基因组还包含5个晚期转录单位(L1、L2、L3、L4和L5)，其转录包括五邻体(L2)、六邻体(L3)、支架蛋白(L4)和纤维蛋白(L5)在内的结构蛋白，其中结构蛋白受单个启动子的控制。基因组的每一末端都包含病毒复制所必需的末端反向重复(ITR)序列。

目前病毒载体的研究都集中在感染能力、特异性、包装容量等方面，而对于包装的外源基因(gene of interest，GOI)对于病毒的影响关注很少，在实践中，有相当一部分外源基因是无法获得有效的病毒颗粒。这是因为，在病毒包装过程中，一方面，外源基因通常由强启动子驱动，其表达对细胞状态，病毒的包装，出毒等过程都有无法预料的影响。

发明内容

本发明涉及一种腺病毒包装载体，具有两个ITR片段及插入两个ITR片段之间的基因表达盒；

所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子以及任选的目的基因；

当有阻遏物存在时，所述阻遏型操作子能够阻遏其下游目的基因的表达。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种腺病毒包装载体系统，其包括如上所述的腺病毒包装载体以及框架载体。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种腺病毒的包装方法，所述方法将包含如上所述的腺病毒包装载体系统转入宿主细胞，并于所述阻遏物存在的前提下进行包装。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

无需判断外源基因是否对腺病毒产生影响，因为没有阻遏物的时候，阻遏系统不会发挥作用，也不会影响目的基因的表达。当发现出毒明显低于平均水平的时候，配合包含阻遏蛋白表达的辅助质粒即可进行抑制外源基因的病毒包装过程，从而排除外源基因的影响，提升特定病毒的产量，无需重新构建新的穿梭载体，节省了大量的时间以及人力和物力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1～图5依次为本发明一个实施例中pcDNA3.1-CymR、CMV-CuO、EF1a-CuO、SFH-CuO、CAG-CuO载体的质粒图谱；

图6为本发明一个实施例中CymR-CuO在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果；