[发明专利]一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法

权利要求书

1.一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法，其特征在于：将野生型乳酸乳球菌菌株中的nisA和nisRK基因克隆到高拷贝数载体中，将得到的质粒pMG36e:nisA和pMG36e:nisRK通过单重和三重转化导入乳酸乳球菌。

2.根据权利要求1所述的一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法，其特征在于，以大肠杆菌DH5a亚型为宿主菌株，进行了质粒的克隆和构建；在培养基中培养大肠杆菌DH5a；利用锥形瓶分批发酵乳酸乳球菌菌株，锥形瓶内包含LM17介质；在30℃，100rpm/min条件下培养18h,培养过程中控制PH；重组菌株的培养基中添加抗生素，大肠杆菌DH5a和乳酸乳球菌培养基中红霉素的用量分别为250μg/ml和5μg/ml；提取乳酸乳球菌的染色体DNA；从提取的基因组DNA中，通过聚合酶链式反应，扩增出乳酸乳酸链球菌素生物合成途径中涉及前体合成和调控的nisA和nisRK基因片段；构建重组表达质粒nisA和nisRK，使用试剂盒将两个含有同源序列的PCR片段按照顺序亚克隆至载体pMG36e上；将重组质粒转化至CaCl₂溶液处理过的大肠杆菌DH5a感受态细胞上，通过筛选在红霉素浓度为250μg/ml的LB琼脂板上生长的单菌落得到转化子；通过限制性内切酶切和DNA测序分析确认构建的DNA质粒；通过使用基因脉冲发生器装置将重组载体成功电转化入乳酸乳球菌菌株。