[发明专利]一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法

说明书

本发明公开了一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法，涉及工业领域，将野生型乳酸乳球菌菌株中的nisA和nisRK基因克隆到高拷贝数载体中，将得到的质粒pMG36e:nisA和pMG36e:nisRK通过单重和三重转化导入乳酸乳球。本发明通过在乳酸乳球菌中引入含有nisRK的多拷贝质粒来提高Nisin的产量。我们设计了携带nisA和nisRK基因的表达质粒，并将工程质粒转入野生型菌株。Nisin作为一种信号分子，可通过双组分信号转导诱导Nisin生物合成基因簇的转录，该信号转导由一个响应调节因子和一个指定nisRK基因的组氨酸激酶组成；在野生型菌株内转化nisA和nisRK多拷贝基因后，其Nisin产量显著提高。

技术领域

本发明涉及工业领域，尤其涉及一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法。

背景技术

乳酸乳球菌用于生产各种发酵乳制品，每年大约有1亿吨牛奶接种了乳球菌。乳酸乳球菌最初被纳入链球菌属，1985年被重新分类为乳球菌属(Song et al.(2017)MicrobCell Fact 16:139)。乳酸乳球菌分为三个亚种，其中乳源的有乳酸乳球菌乳酸亚种(L.lactis subsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp.cremoris)，还有分离自叶蝉的乳酸乳球菌霍氏亚种(L.lactis subsp.hordniae)(Parapouli et al. (2013)Appl Environ Microbiol 79:3476-3484)。乳酸乳球菌主要通过表型特征(生理生化、细胞壁组成、蛋白质印记等)和基因特征(与已知菌相比较，从而得知分类位置)进行鉴定，其中遗传分析具有快速、准确、分辨率高的优点，已经成为乳酸乳球菌鉴定的主要方法。同时16S rRNA技术已经普遍用于乳酸乳球菌的分离和鉴定。迄今已发表了数百个菌株和变异体(Duwat et al.(2011)J Bacteriol 83:4509-4516)。乳酸乳球菌在食品发酵中已经使用了几个世纪，其中一些菌株通过产生细菌素用于食品的防腐。

抗菌肽Nisin是几种革兰氏阳性兼性厌氧菌乳酸乳球菌在生长过程中产生的小肽，是一种由34个氨基酸残基组成的多肽(Liu and Hansen(1990)Appl EnvironMicrobiol 56:2551-2558)。该肽能有效抑制或杀死大多数革兰氏阳性菌，并能阻止孢子的生长(如单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、植物乳杆菌和黄色微球菌(Hampikyan(2009)J Food Prot 72:1739-1743)。由于其优越的抗菌活性和没有毒副作用,Nisin一直被视为一个安全有效的食品级生物防腐剂和添加剂,并广泛应用于食品工业,主要在乳制品、肉类产品、罐头和其他加工食品(Delves-Broughton et al.(1996)AntonieVan Leeuwenhoek 69:193-202)中。由于它对动物无毒，世界卫生组织(1969 年)和食品和药物管理局(FDA)在1988年批准Nisin用于食品添加剂。

Nisin在生物医学领域的潜在应用前景已经被报道(Shin et al. (2016)J ApplMicrobiol 120:1449-1465)。有研究已验证了Nisin作为一种潜在的治疗药物的多种应用方式。例如，Nisin具有类似于人类防御肽的免疫调节特性，Nisin可以作为一种新的免疫调节治疗药物发挥作用。此外，Nisin对治疗头颈部鳞状细胞癌也有一定效果。