[发明专利]一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法

权利要求书

1.一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、实验动物免疫测试；包括N蛋白免疫双峰驼和N蛋白抗体效价的测定；

S2、构建VHH噬菌体文库；包括扩增VHH基因及展示载体构建和纳米抗体文库的构建以及库容量测定；

S3、淘选N特异性纳米抗体；包括文库救援及重组噬菌体滴度测定、淘选N蛋白特异性重组噬菌体、蛋白特异性重组噬菌体富集及粗提物制备和N蛋白重组纳米抗体的ELISA检测。

2.如权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，其特征在于，步骤S1中，

N蛋白免疫双峰驼；将1mL通过亲和层析法纯化的重组N蛋白(1mg/mL)与等体积弗氏完全佐剂混匀，乳化完全后形成油包水状态，注射于骆驼颈部，注射方式为皮下注射；第二次至第五次免疫均采用弗氏不完全佐剂，每次免疫间隔期为两周，第五次免疫五次后通过颈静脉采集外周血200mL；

N蛋白抗体效价的测定；将采集的血液分离出血清用于检测针对N蛋白的抗体效价，未免疫前血清作对照，通过间接ELISA检测血清中抗N蛋白的抗体效价。

3.如权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，其特征在于，步骤S1中，

扩增VHH基因及展示载体构建；

将颈静脉采集的200ml的外周血装入抗凝血采血袋，并加入相同体积的细胞培养基稀释好血液，分离外周血淋巴细胞，使用RNA提取试剂盒进行RNA提取；以提取的RNA作为模板，扩增第一轮，胶回收700bp附近的条带，以cDNA为模板，扩增VHH基因；将第二轮PCR产物进行电泳，切取400bp附近条带，用胶回收试剂盒回收PCR产物；选择PstI和NotI酶切位点进行酶切，同时将VHH基因以及载体基因进行酶切处理，酶切16h后，使用DNA连接酶将VHH连接至pCANTAB5E载体；

纳米抗体文库的构建以及库容量测定

将扩增VHH基因及展示载体构建的连接产物通过电转化至TG1感受态细胞中，转化结束后加入10ML预热的SOC培养基置于37℃摇床中220rpm培养1h；取出50μL菌体涂布于LB/Amp-GLU固体平板上，37℃倒置培养6-8h，用细胞刮铲刮下培养皿上的菌苔，加入浓度为50％的甘油，分装保存于-80℃；取出少量菌液涂板培养12h，计算形状规则的单菌落得到文库库容量，随机挑取47个单菌落进行菌液PCR鉴定。

4.如权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，其特征在于，步骤S3中，

文库救援及重组噬菌体滴度测定；2×TY/Amp-GLU培养基中加入1ML文库菌液，置于摇床培养至对数期，以20个MOI加入M13K07辅助噬菌体，37℃静置30min，离心15min弃上清，使用2×TY/Amp-Kan重悬菌体，37℃，220rpm培养14h，离心40min弃上清，加入PEG/NaCl混匀，4℃静置6h，12000g离心5min后加入1ML PBS重悬；蘸取TG1菌液涂布于M9平板，37℃放置40h，挑取单菌落培养至对数期，用2×TY培养基稀释重组噬菌体，取稀释度为10-9、10-10的样品100μL加入到200μL的TG1菌液中，37℃静置30mi涂布于LB/Amp-GLU平板，37℃恒温培养箱中培养8h，计算噬菌体滴度。

5.如权利要求1所述的一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，其特征在于，步骤S3中，

淘选N蛋白特异性重组噬菌体；每孔包被10μg N蛋白，对照孔包被PBS，加入100μl 3％的BSA，室温封闭1h；PBS’T洗板4次，噬菌体稀释至5×1011pfu/ml加入100μl，25℃孵育1h；洗板结束后加入0.1M三乙胺100μl，置于通风橱静止10min，加入100μl的1M Tris-HCl(pH7.4)中和，测定洗脱下来的噬菌体滴度；取2mL对数生长期的TG1菌液，加入100μl噬菌体溶液混匀，37℃培养箱放置30min，立即加入8mL 2×TY/Amp-GLU培养基，置于摇床中培养至对数生长期；取40μlM13K07辅助噬菌体加入到培养基侵染1h，离心后用2×YT/AMP-KAN重悬，将锥形瓶放入摇床培养12h；重复上述步骤两次，完成三轮淘选过程。