[发明专利]一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法

说明书

本发明涉及一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，包括如下步骤：S1、实验动物免疫测试；包括N蛋白免疫双峰驼和N蛋白抗体效价的测定；S2、构建VHH噬菌体文库；包括扩增VHH基因及展示载体构建和纳米抗体文库的构建以及库容量测定；S3、淘选N特异性纳米抗体；包括文库救援及重组噬菌体滴度测定、淘选N蛋白特异性重组噬菌体、蛋白特异性重组噬菌体富集及粗提物制备和N蛋白重组纳米抗体的ELISA检测。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域。特别涉及一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种急性接触性传染病，临床上主要变现为脱水、严重腹泻、呕吐、肠绒毛萎缩，该病对初生仔猪具有严重危害作用，极易造成哺乳期仔猪死亡，给我国养猪业带来巨大经济损失。完整的TGE病毒包含四种结构蛋白：分别为包裹着基因组RNA的核衣壳蛋白N(简称N蛋白)、脂质囊膜中的膜结合蛋白M，形成病毒凸起的糖蛋白S，小膜蛋白sM。其中N蛋白作为猪传染性肠胃炎病毒的核衣壳蛋白，其本质是一种磷酸化蛋白，包裹着病毒基因组，并在RNA复制加工过程中起重要作用， N蛋白具有很强的保守性，可以做为TGE的诊断抗原。目前，市面上存在TGE的检测试剂盒是基于多克隆抗体和单克隆抗体而制备的，单抗制备过程费时费力，杂交瘤细胞生产单抗所需成本高；多克隆抗体虽制备过程简单，但存在针对表位繁多、特异性低等问题。纳米抗体制备筛选过程简单，分子量小，能够深入抗原结构的缝隙中，识别单克隆抗体识别不到的隐藏表位，还具有高稳定性、高亲和力、易于基因工程改造等优势，可通过不同的表达系统获得，生产成本低，可以作为一种良好的诊断和治疗工具。

骆驼血液中存在的一种特殊形式的抗体，在自然条件下该抗体没有轻链且重链部分缺失第一恒定区(constant region 1，CH1)，被称为重链抗体(heavy chain antibodies,HCAbs)。重链抗体可变区(variable domain of heavy chain antibody，VHH)由四个框架区(framework regoin，FR)和三个互补决定区(complementarity-determining region， CDR)构成。VHH结构长4nm，直径为2.5nm，所以又称纳米抗体 (nanobody，Nb)是自然条件下存在的可与抗原结合的最小片段，相对分子质量15000，为传统抗体的1/10左右。纳米抗体具有分子量小、稳定性好、高亲和力、高特异性和易于基因工程改造等优势，并且可通过不同的表达系统获得，是一种良好的诊断和治疗工具。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法。

为了达到该目的，本发明采用以下技术手段：

一种猪传染性胃肠炎病毒N蛋白抗体效价测定方法，包括如下步骤：

S1、实验动物免疫测试；包括N蛋白免疫双峰驼和N蛋白抗体效价的测定；

S2、构建VHH噬菌体文库；包括扩增VHH基因及展示载体构建和纳米抗体文库的构建以及库容量测定；

S3、淘选N特异性纳米抗体；包括文库救援及重组噬菌体滴度测定、淘选N蛋白特异性重组噬菌体、蛋白特异性重组噬菌体富集及粗提物制备和N蛋白重组纳米抗体的ELISA检测。

作为一种优先的技术方案，步骤S1中，

N蛋白免疫双峰驼；将1mL通过亲和层析法纯化的重组N蛋白(1 mg/mL)与等体积弗氏完全佐剂混匀，乳化完全后形成油包水状态，注射于骆驼颈部，注射方式为皮下注射；第二次至第五次免疫均采用弗氏不完全佐剂，每次免疫间隔期为两周，第五次免疫五次后通过颈静脉采集外周血200mL；

N蛋白抗体效价的测定；将采集的血液分离出血清用于检测针对 N蛋白的抗体效价，未免疫前血清作对照，通过间接ELISA检测血清中抗N蛋白的抗体效价。