[发明专利]一组肠道外致病大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的基因工程大肠杆菌的构建及应用

权利要求书

1.一组合成肠道外致病大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的大肠杆菌底盘细胞，其特征在于：它是基于CRISPR-Cas9的方法删除zwf、pfkB、lacZ、manA和pykA基因得菌株OS12，该菌株细胞能够协同利用葡萄糖和甘油；OS12中O抗原连接酶WaaL和肠杆科共有抗原（enterobacterial common antigen，ECA）被删除，同时原始已失活的O16抗原基因簇被全部删除，构建底盘细胞为OSLA；含有肠道外致病大肠杆菌（extraintestinal pathogenicEscherichia coli, ExPEC）O5和O7抗原合成基因簇分别导入上述底盘细胞OSLA，命名为OSLA-O5和OSLA-O7。

2.权利要求1所述的大肠杆菌底盘细胞，其特征在于所述含有ExPEC血清型O5和O7抗原合成基因簇指的是：通过对实验室保存的从婴幼儿脑脊液中分离的致病大肠杆菌基因组进行测序并定位出其抗原合成基因簇区域，将其转入OSLA菌株。

3.权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于所述含有糖基化系统是指，通过将来自脑膜炎奈瑟球菌（Campylobacter jejuni）并经过大肠杆菌密码子优化的O-糖基转移酶编码基因（undecaprenyl-diphosphooligosaccharide--protein glycotransferase，GI：905417）与合成的P15启动子和BBa_B1002终止子共同导入OSLA-O5、OSLA-O7中，其中P15启动子序列为组成型表达的中等强度启动子。

4.一种权利要求1所述合成肠道外致病大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的大肠杆菌细胞底盘的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）将质粒pCas转化到宿主菌E.coli MG1655 K-12中，获得携带该质粒的宿主菌；

2）以基因组为模板，设计待删除基因的sgRNA以及同源臂，通过Gibson组装的方法体外构建pTarget质粒，并转化感受态细胞DH5α；

3) 提取测序正确的pTarget质粒；

4) 向步骤1所得的携带质粒pCas的宿主菌中转化pTarget质粒，电击复苏后涂布于LB+壮观霉素(50 ug/ml)+L-(+)-arabinose(10 mM)的平板，获得目的基因被删除的重组菌；

5) 以步骤4所得的删除一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤2）3）4）的操作，获得删除zwf、pfkB、lacZ、manA、pykA、waaL、ECA和O16基因簇的重组菌；

6) 所述构建zwf、pfkB、lacZ、manA、pykA、waaL、ECA和O16删除引物和鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-8所示。