[发明专利]一组肠道外致病大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的基因工程大肠杆菌的构建及应用

说明书

本发明公开了一组肠道外致病大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的基因工程大肠杆菌的构建及应用。基于CRISPR‑cas9删除E.coli K‑12 MG1655菌株中zwf、pfkB、lacZ、manA和pykA基因，构建能够协同利用葡萄糖和甘油的菌株，分别用于合成O抗原多糖和维持细菌生理代谢；进一步删除waaL、肠杆科共有抗原（ECA）和O16基因簇，构建底盘细胞为OSLA。分别导入O5和O7抗原合成基因簇，同时导入表达糖基转移酶以及载体蛋白，合成各血清型糖蛋白结合疫苗。纯化的糖蛋白经过动物免疫实验证实能够刺激小鼠产生具有保护性作用的抗体，保护率可以达到90%以上。本发明构建的重组大肠杆菌糖蛋白结合疫苗为抗肠道外致病大肠杆菌感染的免疫治疗提供了新的选择。

技术领域

本发明属于合成生物学技术领域，设计一组肠道外致病大肠杆菌O5和O7糖蛋白结合疫苗的基因工程大肠杆菌的构建及应用。

背景技术

肠道外致病大肠杆菌（extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC）是人畜共患病的病原体，它们通常在人类（和其他动物）的肠道微生物群中占据特定生态位，然后从肠道这个“蓄水池”迁移到其他位点，引起肠道外的感染。ExPEC具有复杂的进化谱系，含有众多的毒力因子，基因组可塑性也较大。这些致病菌株不仅感染泌尿系系统，还会引起菌血症或败血症。根据感染位点的差异，可以简单地将ExPEC分为禽类致病大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli, APEC）、尿路致病大肠杆菌（uropathogenicEscherichia coli, UPEC）和致新生儿脑膜炎大肠杆菌（neonatal meningitis-causingEscherichia coli, NMEC）。这三个簇之间相互有交叉，如，大肠杆菌O2血清型，既能引起禽类感染，也能引起人来的尿路感染；O18血清型引起禽类肠败血症，也会导致新生儿脑膜炎；引起尿路感染的UPEC菌株，通常也能引起严重的败血症。

直到20世纪90年代末，ExPEC对最广泛使用的抗菌药物高度敏感，如氨苄西林和甲氧苄啶磺胺甲恶唑。然而，在过去十年中，ExPEC已成为一线抗菌药物（包括头孢菌素类、氟喹诺酮类，氨苄西林和甲氧苄啶磺胺甲恶唑）的重要耐药库。更让人担忧的是，ExPEC能够对所有主要抗生素的形成耐药性。在早产儿中，由多重耐药ExPEC引起的早发性新生儿败血症发病率呈上升趋势。某些ExPEC菌株能够耐受M型头孢克肟，另一些菌株能够分泌超广谱β内酰胺酶，成为名副其实的多重耐药菌。新生儿败血症和脑膜炎感染的抢救窗口期很短，这类病原体的感染显著增加了治疗难度，延长病患住院时间，并且死亡率致残率也更高。

通常情况下，细菌表面多糖（O抗原、K抗原）可作为细菌的保护性抗原，免疫后可以刺激成熟的B淋巴细胞，激发免疫系统产生强烈的抗体，可以保护机体抵御随后病菌的侵袭。但是，在众多的医学实践中，人们逐渐发现多糖结合疫苗有个重大缺陷——既不能诱导易受细菌感染人群，特别是老人和不超过两岁的孩子形成保护性抗体和记忆效应。其免疫过程没有T细胞的参与，诱导免疫系统产生的抗体主要为IgM，亲和力低，而且存在时间较短。细菌表面多糖可以被化学试剂活化并与载体蛋白共价偶联，形成多糖蛋白结合疫苗。该类疫苗能够诱发机体免疫系统产生更理想的免疫应答，如长效免疫记忆以及在多糖疫苗中不存在的高亲和力的IgG抗体，有效弥补了多糖疫苗的缺陷，是目前为止人类最成功的疫苗，可以给予儿童以抵抗细菌感染并且也可以给成年人提供长时间持续的免疫应答。