[发明专利]一种检测miRNA的方法及一种用于检测miRNA的生物探针

说明书

本发明提供了一种检测miRNA的方法，其包括如下步骤：(1)制备PEG修饰的AuNPs，得AuNPs‑PEG；(2)根据待测miRNA的序列合成与之序列完全配对的DNA片段，此DNA片段5’端连接有亲和素，3’端依次连接含有3‑10个碱基序列及linker、‑SH，形成目标miRNA的DNA探针，linker含有至少一个亚甲基；(3)将上述步骤中的DNA探针与AuNPs‑PEG反应，得PEG‑AuNPs‑DNA probe；(4)将含有或不含有目标miRNA的样本、DSN buffer、DSN、RNase抑制剂、PEG‑AuNPs‑DNA probe进行反应；(5)终止反应，向反应系统中加入链霉亲和素包被的磁性颗粒，进行磁分离，收集磁分离后的溶液，定量检测AuNPs的含量。

技术领域

本发明涉及一种检测miRNA的方法及一种用于检测目标miRNA的生物探针，属于生物技术领域。

背景技术

miRNA的序列片段短、在家族成员之间的序列高度相似，这些特点使miRNA的定量超灵敏检测颇具挑战性，常规的核酸检测方法为qRT-PCR，但该方法操作复杂，对于低浓度miRNA检测，会有较强的背景干扰。

双链特异性核酸酶(DSN)是一种能高效识别并酶切完全互补配对的DNA双链或者DNA/RNA杂交双链中的DNA链，而对单链DNA和单/双链RNA几乎没有作用的核酸酶，且具有容易修饰，催化效率高，化学稳定性好等优点，在miRNA的检测中应用广泛。

已报道的基于DSN的miRNA检测方法包括荧光检测、量子点检测等。荧光检测背噪较多，量子点检测通常需要用到有毒的镉。总之，简单方便且效果好的检测方法仍待开发。

发明内容

本发明提供了一种检测miRNA的方法，其包括如下步骤：

(1)制备PEG修饰的AuNPs，得AuNPs-PEG；

(2)根据待测miRNA的序列合成与之序列完全配对的DNA片段，所述DNA片段5’端连接有亲和素，3’端依次连接含有3-10个碱基序列及linker、-SH，形成目标miRNA的DNA探针，linker含有至少一个亚甲基；

(3)将上述步骤中的DNA探针与AuNPs-PEG反应，得PEG-AuNPs-DNA probe；

(4)将含有或不含有目标miRNA的样本、DSNbuffer、DSN、RNase抑制剂、PEG-AuNPs-DNAprobe进行反应；

(5)终止反应，向反应系统中加入链霉亲和素包被的磁性颗粒，进行磁分离，收集磁分离后的溶液，定量检测AuNPs的含量。

优选地，步骤(1)中，AuNPs采用柠檬酸钠还原法制备；AuNPs-PEG的制备方法为：硅基材料经羟基活化、氨基化之后，与AuNPs溶液反应，去除未结合的AuNPs，与HS-PEG-COOH溶液反应，去除多余的HS-PEG-COOH，超声洗涤，即得AuNPs-PEG。

优选地，步骤(2)中，3’端连接5个相同的碱基序列，linker为3～6个亚甲基。

优选地，步骤(4)中，针对以下反应体系：总反应体积100μL:10nM PEG-AuNPs-DNA，1xDSN buffer，4U RNAase抑制剂，10pM目标miRNA，0.3U DSN，反应体系的温度为45～55℃，DSN浓度为0.4～0.5U，反应时间为80～100min，链霉亲和素磁珠体积为10～20μL。

优选地，步骤(5)中，采用ICP-MS方法检测。

本发明还提供了一种用于检测目标miRNA的生物探针，其包括如下结构：

(1)一段DNA片段，其能与目标miRNA的序列完全配对；

(2)与上述DNA片段一端相连的亲和素，