[发明专利]一种噬菌体活性现场快速检测试方法

权利要求书

1.一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：

S1：RNA提取：采用RNA提取液对待测样本进行RNA提取，得到RNA备用；

S2：采用反转录试剂盒对上述步骤得到的RNA进行反转录，得到cDNA备用；

S3：利用primer 5.0设计引物，引物序列为：

SEQ ID NO.1：5，-TACCGTCCTTTTTCGGCTT-3，；

SEQ ID NO.2：3，-TGGTGGACGATACGCTGGC-5，；

S4：使用PCR反应液配置PCR反应体系，同时设置阳性对照和阴性对照，即获得阳性对照管、待测管和阴性对照管；

S5：将上述阳性对照管、待测管和阴性对照管放入到PCR仪中设定PCR参数，进行PCR扩增；

S6：取上述扩增结束的PCR液2μL，进行琼脂糖凝胶电泳，将待测管中与阳性对照管对应的条带进行回收测序，为所需条带序列，则选用步骤S2中的引物序列为实时定量的引物；

S7：利用上述噬菌体的cDNA为模板，加入实时定量试剂进行实时定量实验，来检测噬菌体的活性。

2.根据权利要求1所述的一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：所述步骤S1中的RNA提取液包括氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H₂O，且氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H₂O采用不同的试剂瓶盛装。

3.根据权利要求1所述的一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：所述步骤S4中PCR反应液包括13μM Taq DNA聚合酶50μL、150μM dNTP 100μL、SyBr染料200μL、15μM尿嘧啶糖基化酶50μL。

4.根据权利要求3所述的一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：所述步骤S4中PCR反应体系为20μL，包括所述PCR反应液15μL、所述引物SEQ ID NO.1 1μL、所述引物SEQ ID NO.2 1μL以及噬菌体cDNA3μL。

5.根据权利要求1所述的一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：所述步骤S5中PCR反应循环参数为：

94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性15-30s，50-60℃退火1min，72℃延伸20s，35个循环；10℃停止。

6.根据权利要求1所述的一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：所述步骤S1中RNA提取的具体步骤为取少量待测样本2-4μL，加入相应5倍体积的RNA提取液，均匀混合后置于水浴锅中，水浴锅的温度为60℃，放置30-50min，取出后涡旋震荡仪震荡5-10min，然后再放入65℃的水浴锅中20min，取出后加入等体积的异丙醇，室温放置5min，12000rpm离心5min后弃上清，然后静置1-2h，使其溶液挥发，加入20μL无菌水溶解制得所述样品RNA。