[发明专利]一种噬菌体活性现场快速检测试方法

说明书

本发明公开了一种噬菌体活性现场快速检测试方法，包括S1：RNA提取；S2：反转录；S3：引物设计；S4：配置PCR反应体系；S5：PCR扩增；S6：测序；S7：实时定量检测。本发明采用PCR和实时定量的方式，对噬菌体活性进行检测，使得检测的精确度和准确度更好；且在RNA提取提取的加入异丙醇离心后，静置1‑2h能够保证试管中的溶液挥发完全，从而得到的RNA浓度更高，为后续的检测提供保证。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种噬菌体活性现场快速检测试方法。

背景技术

噬菌体(Bacteriophage)是在1907年和1909年分别由Twort和D.Herelle各自独立发现，噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。噬菌体作为病毒的一种，具有病毒特有的一些特性：个体微小；不具有完整细胞结构；只含有单一核酸。噬菌体基因组含有许多个基因，但所有已知的噬菌体都是在细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖，一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。

发酵工业常受噬菌体的危害，当出现噬菌体的时，轻则导致发酵周期长、影响产量，重则引起工厂停产，例如在发酵工业应用较广泛的是枯草芽孢杆菌，由于其具有发酵周期短、产物丰富、可利用开发价值高等优点，使它能够应用在食品加工、农业生产、能源开发等多个方面，但枯草芽孢杆菌极易感染噬菌体，枯草芽孢杆菌发酵工业受到的危害也尤其严重，因此对噬菌体活性的检测显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种噬菌体活性现场快速检测试方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种噬菌体活性现场快速检测试方法，按照先后顺序包括以下步骤：

S1：RNA提取：采用RNA提取液对待测样本进行RNA提取，得到RNA备用；

S2：采用反转录试剂盒对上述步骤得到的RNA进行反转录，得到cDNA备用；

S3：利用primer 5.0设计引物，引物序列为：

SEQ ID NO.1：5，-TACCGTCCTTTTTCGGCTT-3，；

SEQ ID NO.2：3，-TGGTGGACGATACGCTGGC-5，；

S4：使用PCR反应液配置PCR反应体系，同时设置阳性对照和阴性对照，即获得阳性对照管、待测管和阴性对照管；

S5：将上述阳性对照管、待测管和阴性对照管放入到PCR仪中设定PCR参数，进行PCR扩增；

S6：取上述扩增结束的PCR液2μL，进行琼脂糖凝胶电泳，将待测管中与阳性对照管对应的条带进行回收测序，为所需条带序列，则选用步骤S2中的引物序列为实时定量的引物；

S7：利用上述噬菌体的cDNA为模板，加入实时定量试剂进行实时定量实验，来检测噬菌体的活性。

优选的是，所述步骤S1中的RNA提取液包括氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H₂O，且氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H₂O采用不同的试剂瓶盛装。

上述任一方案中优选的是，所述步骤S4中PCR反应液包括13μM Taq DNA聚合酶50μL、150μM dNTP 100μL、SyBr染料200μL、15μM尿嘧啶糖基化酶50μL。

上述任一方案中优选的是，所述步骤S4中PCR反应体系为20μL，包括所述PCR反应液15μL、所述引物SEQ ID NO.1 1μL、所述引物SEQ ID NO.21μL以及噬菌体cDNA 3μL。