[发明专利]一种免扩增的RNA定量检测方法在审
| 申请号： | 202011429693.8 | 申请日： | 2020-12-09 |
| 公开（公告）号： | CN112813143A | 公开（公告）日： | 2021-05-18 |
| 发明（设计）人： | 舒博文;周小明;田甜 | 申请（专利权）人： | 广州市第一人民医院（广州消化疾病中心;广州医科大学附属市一人民医院;华南理工大学附属第二医院）;华南师范大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 广州骏思知识产权代理有限公司 44425 | 代理人： | 李国钊 |
| 地址： | 510000 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 扩增 rna 定量 检测 方法 | ||
1.一种免扩增的RNA定量检测方法，包括以下步骤：
S1：设计与目标RNA碱基互补配对且含5’端重复序列茎环结构的crRNA序列；
S2：配制Cas13反应体系；
S3：将待测物与所述Cas13反应体系混合，将该混合体系分散到大量尺寸均一且体积不超过纳升极的微反应单元，并提供适宜的温度条件孵育微反应单元；
S4：完成孵育反应后读取微反应单元信号，设定判定阴性/阳性信号的强度阈值，计算待测样品中目标RNA的含量。
2.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S2中所述的Cas13反应体系配制包括以下组分：Cas13效应蛋白、crRNA、RNA报告探针和反应缓冲液。
3.根据权利要求2所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S2中所述Cas13反应体系中，Cas13效应蛋白在反应体系的终浓度为10nM-100nM，crRNA在反应体系的终浓度为5nM-200nM，RNA报告探针在反应体系的终浓度为200nM-1000nM。
4.根据权利要求2所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S2中所述Cas13反应体系中，Cas13效应蛋白在反应体系的终浓度为20nM，crRNA在反应体系的终浓度为10nM，RNA报告探针在反应体系的终浓度为300-500nM。
5.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S2中所述Cas13反应体系中，反应缓冲液pH为8.9，包括以下组分：10mM Tris-HCl、1.5mM MgCl2、50mM KCl。
6.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S3中所述的混合体系分散到大量体积均一的微反应单元的方式包括微腔室阵列方式和微液滴乳化方式。
7.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S3中的微反应单元的有效体积不超过20nL，包含目标RNA的待测物与预混反应液混合到分配到足够数目微反应单元之间的延迟时间不超过15分钟。
8.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S3中，所形成的微反应单元的孵育温度为25-40℃，孵育反应时间不超过90分钟。
9.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S4中，计算待测样品中目标RNA的含量的方法为统计阳性液滴的总数，或者统计阳性液滴数目在液滴总数所占的比例。
10.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S4中，计算待测样品中目标RNA的含量的方法为利用泊松分布原理计算待测标本中目标RNA的原始浓度。
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