[发明专利]一种免扩增的RNA定量检测方法

说明书

本发明公开了一种免扩增的RNA定量检测方法，包括以下步骤：设计与目标RNA碱基互补配对且含5’端重复序列茎环结构的crRNA序列；配制Cas13反应体系；将待测物与所述Cas13反应体系混合，将该混合体系分散到大量尺寸均一且体积不超过纳升级的微反应单元，并提供适宜的温度条件孵育微反应单元；完成孵育反应后读取微反应单元信号，计算待测样品中目标RNA的含量。本发明所述的免扩增的RNA定量检测方法，可实现单分子水平的RNA定量检测，无需内参校正和建立标准曲线，无需反转录及核酸复制步骤，也无需进行标记和功能修饰，恒温反应无需热循环，操作步骤简单且检测精度高。

技术领域

本发明涉及分子生物检测领域，特别涉及一种免扩增的RNA检测及其单分子定量检测方法。

背景技术

核糖核酸RNA(Ribonucleic Acid)，是一种广泛存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA的碱基主要有4种，即A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)，其中U取代了DNA中的T(胸腺嘧啶)。RNA存在多种形式，包括基因组RNA、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖RNA(rRNA)和一系列非编码RNA(如microRNA、lncRNA、circRNA、snRNA、cfRNA等)，各自在生命进程中发挥着不同的重要作用。例如，microRNA参与调控一系列的细胞功能如细胞增殖、分化和死亡等，同时miRNAs可通过致癌和抑癌的双向功能参与多种实体瘤的细胞通路，因而miRNAs被认为是疾病早期诊断、预后和治疗监测的重要生物标志物。

然而,由于RNA自身的一些特性如片段长度短、序列相似度高、表达差异跨度大、环境背景复杂，使得其检测特别是单分子水平的定量分析存在重重挑战。传统的NorthernBlotting和高通量测序需要进行一系列的复杂操作、样本消耗量大、分析耗时长、而且检测灵敏度较低。基于RT-PCR技术的qRT-PCR、ddPCR方法和基于CRISPR(规律间隔性成簇短回文重复序列)效应蛋白的系列核酸扩增检测技术(包括“SHERLOCK系统”及其改进版本)具有较高的检测灵敏度，但是其过程涉及的逆转录和核酸扩增等步骤易受多种因素干扰而影响定量检测的准确性。目前，新近发展的一系列基于标记和修饰技术的RNA定量检测方法也由于其标记/修饰过程的复杂性也在一定程度上限制了其广泛适用性。

发明内容

本发明为解决现有RNA定量检测技术存在的不足，提供一种可实现单分子灵敏度、单碱基特异性的免扩增绝对数字化定量RNA的方法。

本发明的目的是通过以下技术方实现的：

一种免扩增的RNA定量检测方法，包括以下步骤：

S1：设计与目标RNA碱基互补配对且含5’端重复序列茎环结构的crRNA序列；

S2：配制Cas13反应体系；

S3：将待测物与所述Cas13反应体系混合，将该混合体系分散到大量体积均一的微反应单元，并提供适宜的温度条件孵育微液滴；

S4：完成孵育反应后读取微液滴信号，设定液滴阴性/阳性的信号强度阈值，计算待测样品中目标RNA的含量。

进一步，步骤S2中所述的Cas13反应体系配制包括以下组分：Cas13效应蛋白、crRNA、RNA报告探针和反应缓冲液。

进一步，步骤S2中所述Cas13反应体系中，Cas13效应蛋白在反应体系的终浓度为10nM-100nM，crRNA在反应体系的终浓度为5nM-200nM，RNA报告探针在反应体系的终浓度为200nM-1000nM。

进一步，步骤S2中所述Cas13反应体系中，Cas13效应蛋白在反应体系的终浓度为20nM，crRNA在反应体系的终浓度为10nM，RNA报告探针在反应体系的终浓度为300-500nM。