[发明专利]一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对、反应冻干管及试剂盒

权利要求书

1.一种用于新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测的试剂盒，其特征在于，包括：

核酸释放剂1mL×96管；

反应缓冲液2.5mL；

阳性对照品1管；

阴性对照品0.5mL；

反应冻干管8管/条×12条；

所述反应冻干管包含：

指示剂60-180 μM；

固体石蜡20-30 mg；

Bst DNA Polymerase0.25-1 U/μL；

AMV Reverse Transcriptase0.2-0.5 U/μL；

dNTP1.4-3.5 mM；

FIP和BIP0.8-1.6 μM；

LF和LB0.4-0.8 μM；

F3和B30.2-0.4 μM；

冻干保护剂30%-50%；

其中：

所述FIP采用引物FIP-Orf1ab、FIP-E或FIP-N；

其中，FIP-Orf1ab的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，FIP-E的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示，FIP-N的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.15所示；

所述BIP采用引物BIP-Orf1ab、BIP-E或BIP-N；

其中，BIP-Orf1ab的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，BIP-E的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示，BIP-N的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.16所示；

所述LF采用引物LF-Orf1ab、LF-E或LF-N；

其中，LF-Orf1ab的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF-E的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示，LF-N的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.17所示；

所述LB采用引物LB-Orf1ab、LB-E或LB-N；

其中，LB-Orf1ab的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示，LB-E的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.12所示，LB-N的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.18所示；

所述F3采用引物F3-Orf1ab、F3-E或F3-N；

其中，F3-Orf1ab的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，F3-E的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示，F3-N的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示；

所述B3采用引物B3-Orf1ab、B3-E或B3-N；

其中，B3-Orf1ab的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，B3-E的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示， B3-N的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.14所示；

所述指示剂为二甲酚橙、酚红、甲酚红、溴麝香草酚蓝或中性红；

所述冻干保护剂，包括：

0.2-0.4M 海藻糖；

0.1-0.25M 肌醇；

1%-5% 甘露醇；

1%-6% 甘氨酸；

0.5%-2% PVP30；

该反应冻干管的制备方法如下：

在每个反应冻干管加入固体石蜡，然后加热，待石蜡彻底融化后加入1μL 0.9-2.7mM的指示剂，然后迅速转移至冰浴条件下，通过石蜡将指示剂密封在反应冻干管管底；

待石蜡彻底凝固后加入Bst DNA Polymerase、AMV Reverse Transcriptase、dNTP、引物对和冻干保护剂，混合均匀后每个反应冻干管分装15μL，-80℃预冷2小时后进行冷冻干燥处理6小时，制得。

2.如权利要求1所述的用于新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂，包括：

1-10 mM的Tris-HCl，0.1-5 mM的EDTA，0.001-0.05%的十二烷基二甲基苄基氯化铵或十二烷基二甲基苄基溴化铵。

3.如权利要求1所述的用于新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品，采用以下方法制得：

合成含有SARS-CoV2 E基因、N基因和orf1ab序列的基因片段，并连接至pUC57载体上，然后转入DH5α感受态细胞，过夜培养，提取质粒DNA，经过冷冻干燥处理获得阳性对照品；

所述阴性对照品采用无菌超纯水。

4.如权利要求1所述的用于新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液，包括：1.5%的支链多糖，8 mM的MgSO₄，20 mM的Tris-HCl，20mM (NH₄)₂SO₄，50 mM的KCl，0.5%的Tween-20。