[发明专利]一株光滑假丝酵母及其在葡萄酒酿造过程中增加品种香气的应用

权利要求书

1.一株光滑假丝酵母，其特征在于，保藏编号:CGMCC No.20634。

2.如权利要求1所述的光滑假丝酵母在生产葡萄酒中的应用。

3.一种生产葡萄酒的方法，是利用如权利要求1所述的光滑假丝酵母通过独立发酵葡萄原料或混合酿酒酵母发酵葡萄原料，得到葡萄酒。

4.一种高通量筛选具有高产β-葡萄糖苷酶特征的酵母的方法，可得到如权利要求1所述的光滑假丝酵母，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取出在甘油管中冻存的菌株，解冻后按照10％的比例接种于液体YPD培养基中，在28℃恒温培养箱中培养48h，使用接种环蘸取少量菌液在WL固体培养基上进行平板划线，划线完成的平板在28℃恒温培养箱中培养48h；

(2)用接种环挑取WL平板上的目标单菌落接种到液体YPD培养基中培养，然后重复上述平板划线的步骤，每种酵母做3个平行，若新的WL平板上没有出现杂菌，则可以用其进行后续试验，否则应该重复上述操作，直到将菌株纯化为止；

(3)向96孔板每孔添加200μL的pNPG筛选培养基，待培养基凝固后，将(2)所得纯化的菌液接种到96孔板上，每个孔接种15μL，每种菌液接种3个孔作为平行试验，记录好每个板孔所对应的单菌落编号，将96孔板置于28℃培养箱恒温培养72h后，向每个孔加入10μL浓度为1mol/L的碳酸钠溶液并静置10min，孔内黄色的深浅即反映了菌株β-葡萄糖苷酶活性的高低；

(4)向液体YPD培养基中接种已经纯化的菌液，接种比例5％，并在28℃、180rpm的振荡培养箱中培养24h，培养完成后，再将菌液以10％的比例接种于产酶培养基，在28℃、150rpm的振荡培养箱中培养72h，将培养完成后的发酵液在4℃、12000rpm的高速离心机中离心15min，取上清液并经过0.45μm滤膜过滤，最终得到酵母菌株的β-葡萄糖苷酶提取液，该提取液置于4℃条件下保存，可应用于β-葡萄糖苷酶活性和和酶学性质的研究；

(5)选用不同浓度的pNP标准溶液(以1mol/L的碳酸钠定容)，以碳酸钠溶液作为空白对照，用分光光度计在390-410nm进行全波长扫描，得到显色产物的最大吸收波长，然后在最大吸收波长处绘制pNP标准曲线，取0.2mL的β-葡萄糖苷酶提取液，加入1.5mL pH 5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液后，在50℃的恒温水浴锅中预热10min，然后向反应体系加入1mmol/L的底物pNPG溶液，每个平行加入0.5mL，30min后立即加入1mol/L的碳酸钠溶液2mL终止反应，待样品冷却至室温之后，以加热失活的β-葡萄糖苷酶提取液作为对照组，测定反应液在最大吸收波长处的吸光值，并根据标准曲线计算出酶活力的大小；

(6)通过以(5)所得结果对比(4)显色的结果，筛选得到具有高产β-葡萄糖苷酶的酵母菌株。