[发明专利]一种提取降纤酶前提原料的制备方法

权利要求书

1.一种提取降纤酶前提原料的制备方法，其特征在于，包括至少以下步骤：

步骤1：将10 g蛇毒溶于缓冲液A中，离心，将上清液收集于洁净瓶中；

步骤2：将步骤1中所收集的上清液以一定的速度上样于A柱中，并用缓冲液B在一定流速下等度洗脱至紫外基线平稳，然后用缓冲液B经梯度洗脱后将具有酶活性的蛋白峰溶液收集至洁净瓶中；

步骤3：将步骤2中收集的具有酶活性的蛋白峰溶液在一定条件下经超滤器超滤浓缩，并用B柱缓冲液A清洗收集至洁净瓶中备用；

步骤4：将步骤3收集的液体以一定的流速上样于B柱，并用缓冲液C在一定流速下等度洗脱至紫外基线平稳，然后用缓冲液C进行梯度洗脱，并收集具有酶活性的蛋白峰溶液；

步骤5：将步骤4中收集的具有酶活性的蛋白峰溶液在一定条件下经超滤器超滤，并用C柱缓冲液D清洗收集至洁净瓶中备用；

步骤6：将步骤5中超滤置换后的溶液以一定的流速上样于C柱，并用缓冲液C在一定流速下等度洗脱至紫外基线平稳，然后用缓冲液C进行梯度洗脱，并收集具有酶活性的蛋白峰溶液；

步骤7：将步骤6收集的具有酶活性的蛋白峰溶液分次装入超滤器中，并在一定条件下超滤浓缩，并用D柱缓冲液D清洗收集至洁净瓶中备用；

步骤8：将步骤7中超滤置换后的液体以一定流速上样于D柱，用缓冲液E在一定流速下进行洗脱，收集具有酶活性的蛋白峰溶液，即得精品降纤酶溶液；

步骤9：将步骤8中得到精品降纤酶溶液装入超滤器中，并在一定条件下超滤置换，在超滤置换过程中，在超滤器中加入适量的注射用水，且重复超滤置换三次，然后用适量的注射用水清洗收集，接着将所得的收集液混合均匀，即得降纤酶溶液，计量体积。

2.根据权利要求1所述的一种提取降纤酶前提原料的制备方法，其特征在于：将步骤9制得的降纤酶溶液经20nm的过滤膜过滤以进行病毒灭活，收集经病毒灭活的滤液并计量体积，然后取样送检、密封、贴标签并在0-10℃下保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种提取降纤酶前提原料的制备方法，其特征在于：

缓冲液A为pH值为6.0-6.5、0.1M 的Tris缓冲液；

缓冲液B为含有0.2M NaCl、pH6.0～6.5、0.1M 的Tris缓冲液；

缓冲液C为含有0.5M NaCl、pH6.5～7.0、0.5M 的乙酸钠缓冲液；

缓冲液D为含有0.1M NaCl、pH6.5～7.0、0.5M 的乙酸钠缓冲液；

缓冲液E为含有0.5M 硫酸盐、pH6.0～6.5、0.1M 的Tris缓冲液；

A柱采用DEAE-Sepharose F.F层析柱；B柱采用UniGel-DEAE层析柱；C柱采用UniCore-DEAE层析柱；D柱采用NanoHR Pheny层析柱。

4.根据权利要求3所述的一种提取降纤酶前提原料的制备方法，其特征在于：步骤1中离心时转速为5000RPM，离心时间为10min；步骤2中上清液以8-12ml/min的速度上样于A柱中，缓冲液B的浓度为10%，并在14-16ml/min的流速下进行等度洗脱，缓冲液B以10%-100%的梯度进行洗脱，梯度洗脱速度为14-16ml/min，梯度洗脱时间为200-240min。

5.根据权利要求3所述的一种提取降纤酶前提原料的制备方法，其特征在于：步骤1-步骤9中所用到的超滤器均采用分子量不大于10KDa的超滤膜，且在氮气氛围下以0.2-0.4MPa的压力进行超滤浓缩，步骤3中超滤浓缩后液体体积不大于20ml，然后用150-200ml的缓冲液A清洗收集；步骤5中超滤浓缩后液体体积不大于15ml，然后用80-100ml缓冲液A清洗收集；而步骤7中超滤浓缩后液体体积不大于10ml，然后用60-80ml缓冲液A清洗收集。

6.根据权利要求3所述的一种提取降纤酶前提原料的制备方法，其特征在于：步骤4中将步骤3收集的液体以8-12ml/min的流速上样于B柱，并用30%的缓冲液B在14-16ml/min的流速下等度洗脱至紫外基线平稳，然后用缓冲液B以30%-100%的梯度进行洗脱，洗脱速度为14-16ml/min，梯度时间为160-200min。