[发明专利]一种提取降纤酶前提原料的制备方法

说明书

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种提取降纤酶前提原料的制备方法，该方法包括多步阴离子交换层析以及疏水层析等多次不同原理的层析分离，并对分离后的液体进行病毒灭活处理，提高其纯度和安全性，此外，这种制备方法缩短了分离提纯降纤酶的周期，提高了生产效率，从而提高了其在市场中的竞争力。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种提取降纤酶前提原料的制备方法。

背景技术

降纤酶是由多组分的蝮蛇抗栓酶经过提取、纯化而成的单组分的新的蛇毒酶类，其分子量较小，从而避免了多组分抗栓酶可能出现的神经毒性与出血的不良反应，其由17种氨基酸、263个残基组成，性能稳定，同时，降纤酶的抗凝血作用很强，能够显著地增强纤溶系统性和活力，降低血小板聚集，对实验性血栓形成有防治作用，因此具有溶解血栓、抑制血栓形成，改善微循环、促进神经细胞恢复的作用，在临床上降纤酶主要用于急性脑梗死、改善各种闭塞性血管病、改善末梢及微循环障碍。

目前，国内外公开的降纤酶的制备方法较多，但这些制备方法的收率均较低，这就导致其活性低、染菌污染的风险较大。

发明内容

本发明提供了一种提取降纤酶前提原料的制备方法，以解决目前降纤酶提取过程中收率低的问题。

本发明所采用的技术方案是：一种提取降纤酶前提原料的制备方法，包括至少以下步骤：

步骤1：将10 g蛇毒溶于缓冲液A中，离心，将上清液收集于洁净瓶中；

步骤2：将步骤1中所收集的上清液以一定的速度上样于A柱中，并用缓冲液B在一定流速下等度洗脱至紫外基线平稳，然后用缓冲液B经梯度洗脱后将具有酶活性的蛋白峰溶液收集至洁净瓶中；

步骤3：将步骤2中收集的具有酶活性的蛋白峰溶液在一定条件下经超滤器超滤浓缩，并用B柱缓冲液A清洗收集至洁净瓶中备用；

步骤4：将步骤3收集的液体以一定的流速上样于B柱，并用缓冲液C在一定流速下等度洗脱至紫外基线平稳，然后用缓冲液C进行梯度洗脱，并收集具有酶活性的蛋白峰溶液；

步骤5：将步骤4中收集的具有酶活性的蛋白峰溶液在一定条件下经超滤器超滤，并用C柱缓冲液D清洗收集至洁净瓶中备用；

步骤6：将步骤5中超滤置换后的溶液以一定的流速上样于C柱，并用缓冲液C在一定流速下等度洗脱至紫外基线平稳，然后用缓冲液C进行梯度洗脱，并收集具有酶活性的蛋白峰溶液；

步骤7：将步骤6收集的具有酶活性的蛋白峰溶液分次装入超滤器中，并在一定条件下超滤浓缩，并用D柱缓冲液D清洗收集至洁净瓶中备用；

步骤8：将步骤7中超滤置换后的液体以一定流速上样于D柱，用缓冲液E在一定流速下进行洗脱，收集具有酶活性的蛋白峰溶液，即得精品降纤酶溶液；

步骤9：将步骤8中得到精品降纤酶溶液装入超滤器中，并在一定条件下超滤置换，在超滤置换过程中，在超滤器中加入适量的注射用水，且重复超滤置换三次，然后用适量的注射用水清洗收集，接着将所得的收集液混合均匀，即得降纤酶溶液，计量体积。

优选地，将步骤9制得的降纤酶溶液经20nm的过滤膜过滤以进行病毒灭活，收集经病毒灭活的滤液并计量体积，然后取样送检、密封、贴标签并在0-10℃下保存备用。

优选地，缓冲液A为pH值为6.0-6.5、0.1M 的Tris缓冲液；

缓冲液B为含有0.2M NaCl、pH6.0～6.5、0.1M 的Tris缓冲液；

缓冲液C为含有0.5M NaCl、pH6.5～7.0、0.5M 的乙酸钠缓冲液；

缓冲液D为含有0.1M NaCl、pH6.5～7.0、0.5M 的乙酸钠缓冲液；