[发明专利]一株BCG_0349基因缺失重组卡介苗及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株基因缺失重组卡介苗，该菌株缺失的基因是核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的BCG_0349基因，属于人兽共患病防治技术领域。本发明通过温敏型噬菌体转导介导的同源重组方式将包含BCG_0349基因上下游同源臂的同源交换底物转导进卡介苗基因组中进行BCG_0349基因敲除，成功构建该菌株并首次确认了缺失株能促进机体炎性细胞因子的表达和分泌，同时毒力致弱，具体体现在索状结构形成能力降低和小菌落表型，胞内存活能力降低更易于被机体所清除，本发明具有在人及动物结核病诊断、疫苗和药物开发等相关领域良好的应用潜能。

技术领域

本发明属于人兽共患病防治技术领域，涉及卡介苗，尤其是一株基因缺失重组卡介苗，本发明还涉及该菌株的构建方法及其应用。

背景技术

牛结核病是多种动物和人共患的一种慢性消耗性人兽共患病，给世界养牛业和公共健康带来了巨大的经济损失。牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)是导致牛结核病的主要病原菌，它与人结核病的主要致病菌结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)在基因水平上有99.95％的同源，因此感染谱相互交叉，两者几乎可以感染所有的脊椎动物，包括人。正因如此，目前用于预防人结核病的唯一官方疫苗就是牛分枝杆菌的体外传代致弱菌株-牛分枝杆菌卡介苗(Mycobacterium bovis BacilleCalmette-Guerin，M.bovis BCG)。1921年法国开始将BCG作为人结核病的预防性疫苗，此后逐渐延伸到全球。迄今为止仍是用来预防人结核病的唯一获得许可使用疫苗，部分国家也用来预防动物结核病。然而，虽然卡介苗拯救了数以万计的生命，但对许多特殊群体尤其是免疫低下群体(如艾滋病人)而言，卡介苗不仅无法实现其免疫保护功能，反而加速了结核病的发生。为解决这一问题，越来越多的学者致力于开发更为安全有效的结核病疫苗，但至今却仍没有优于卡介苗的疫苗问世。因此，从不同角度探讨开发出不影响卡介苗保护效力，且针对免疫低下群体更为安全的卡介苗具有十分重要的意义。

分枝杆菌含有大量功能各异的表面蛋白和分泌蛋白，其中一部分蛋白质锚定在细菌的细胞壁和细胞膜上或者直接分泌出胞外，直接暴露于病原菌的生长环境当中(如巨噬细胞吞噬体或组织肉芽肿中)，参与病原与宿主的互作，调控病原菌的胞内存活和宿主的免疫反应。例如结核分枝杆菌表面蛋白Mce3E通过抑制宿主ERK1/2信号通路的激活来下调TNF-α和IL-6等炎性细胞因子的产生来提高胞内菌的存活^[1]；PPE家族蛋白PPE18通过抑制NF-κB/Rel介导的信号通路抑制由LPS刺激巨噬细胞所产生的IL-12和TNF-α因子，促进机体免疫反应向Th2方向极化^[2]；PtpA蛋白则能够利用宿主细胞的泛素化系统来干扰宿主天然免疫的激活，进而提高感染过程中细菌的胞内存活能力^[3]。可见，结核分枝杆菌表面蛋白作为效应分子在与宿主的互作中发挥着重要的作用，可以通过干扰宿主的免疫反应避免细菌被宿主清除，进而促进结核分枝杆菌建立感染。

索状因子是卡介苗细胞壁糖脂中的一种潜在炎性调节因子，影响着细菌的排列形态。已经被证实的是，索状因子能够影响细胞呼吸，抑制白细胞游走和引起慢性肉芽肿，在结核感染中起着重要的作用^[4]。索状结构是致病性分枝杆菌的特有表型，根据有无索状结构，分枝杆菌可表现为粗糙型或光滑型，两者的毒力存在差异。如脓肿分枝杆菌的光滑型被认为不具备侵袭能力，而粗糙型则具有更强的侵袭能力^[5]。索状因子的形成涉及多种细菌表面蛋白的共同参与，如脂肪酸辅酶A合成酶FadD26缺失可导致结核分枝杆菌突变株表现出索状因子消失，并在小鼠模型中减毒^[6]。因此，分枝杆菌的索状结构形态是细菌毒力的重要指征之一。