[发明专利]一种DNA检测方法

说明书

本发明涉及一种DNA检测方法，包括：利用含有Cas12a/crRNA复合物的反应体系与含有待测dsDNA的样品进行反应，所述dsDNA含有PAM序列；将与所述样品反应后的反应体系添加至经非目标ssDNA连接的磁颗粒体系；检测磁颗粒体系磁信号的变化，其中，待测dsDNA特异性识别Cas12a/crRNA复合物从而激活Cas12a/crRNA复合物的切割非目标ssDNA的活性。本发明所涉及的方法将CRISPR‑Cas12a的精准靶向能力和TMR生物传感器的超高灵敏度的优点相结合，克服了传统方法中光学信号抗干扰能力差的缺点，且获得了更高的灵敏度。此外，由于crRNA的设计中与靶序列互补的20个碱基是可编程的，TMR传感器的样品需求量小，成本低。因此，具有很高的应用和商业价值。

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体地，涉及一种DNA检测方法。

背景技术

近几十年来，基于核酸的体外扩增技术形成的分子诊断方法得到了大量的发展和优化，如PCR，他们可以被用于对多重病理的生物标志物进行检查分析和鉴定。这些工具具有为医生提供准确信息的能力，以改善患者的治疗效果并引入精确的医疗方法。尽管核酸检测技术取得了显着进步，但这些核酸检测工具中的大多数使用起来耗时且成本高，因为它们需要多步反应，多种试剂，训练有素的人员和复杂的仪器。这些核酸扩增技术的定量分析通常需要复杂的探针/引物设计和优化以进行对目标分子的有效靶向。此外，大多数的检测依赖大型的光学仪器，而光学信号在复杂环境样品中存在背景颜色和光线的干扰问题，导致灵敏度不能满足应用的要求。而某些核酸分子，如ctDNA，在体内的浓度极低，对于他们的检测方法就需要更高的灵敏度和更强的抗干扰能力。

因此，需要新的方法来克服与常规核酸检测策略相关的限制，以提供高灵敏度和抗干扰能力强的核酸诊断工具以扩展其临床效用。

在最近的研究中，CRISPR(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)相关的核酸酶(CAS)的方法已被用于核酸的光学检测。CRISPR-Cas蛋白由单链RNA引导，是序列特异性靶向和检测的有力工具。例如，在2017年，Gootenberg等人(Gootenberg J S,Abudayyeh O O,Lee J W,et al.Nucleic acid detection withCRISPR-Cas13a/C2c2[J].Science,2017,356(6336):438-442.)报道了SHERLOCK核酸检测方法，该方法利用靶向Cas13a(CRISPR相关核酸酶13a)的RNA引导能力，在有靶标RNA时，Cas13a与其靶序列复合杂交后激活酶切特性，切割荧光探针产生荧光信号，且通过重组酶聚合酶扩增(RPA)来提高灵敏度。2018年，Li等人(Li S Y,Cheng Q X,Wang J M,etal.CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection[J].Cell discovery,2018,4:20.)报道了HOLMES方法，2017年，Chen等人报道了DETECTR方法(Chen J S,Ma E,Harrington L B,et al.CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminatesingle-stranded DNase activity[J].Science,2018,360(6387):436-439.)，均利用靶向DNA的Cas12a结合PCR来实现DNA检测，去除了SHERLOCK对DNA序列检测所需的DNA到RNA转换步骤。SHERLOCK、HOLMES和DETECTR都利用CRISPR-Cas蛋白识别核酸靶标后的对单链核酸探针的切割能力对DNA和RNA进行特异性检测。由于CRISPR-Cas引导RNA的可编程性，可以很方便的对其进行修改以检测不同的目标。然而，它们仍依赖于荧光探针的荧光信号输出，灵敏度和抗干扰能力不够强。