[发明专利]柑橘黄龙病亚洲种的RAA荧光检测方法、引物探针及试剂盒

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测柑橘黄龙病亚洲种RAA荧光法检测的引物、探针和试剂盒。本发明基于RAA技术开发的柑橘黄龙病病菌亚洲种检测方案解决了现有技术检测方法在检测柑橘黄龙病病菌亚洲种中所存在的费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高等问题。具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简单等特点。只需在39℃下反应5～20分钟便可分析结果。具有快速、灵敏、操作简便等特点，对未来检测柑橘黄龙病病菌亚洲种传播具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测柑橘黄龙病亚洲种RAA荧光法检测的引物、探针和试剂盒。

背景技术

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)是柑橘生产中危害最严重的检疫性病害之一，黄龙病病原属于韧皮部杆菌属的一种革兰氏阴性菌，其中亚洲种CandidatusLiberibacter asiaticus(Las)是全世界柑橘的主要致病菌种。柑桔感染黄龙病后，出现叶片斑驳型黄化，果实变小、畸形，部分品种出现红鼻子果、青果等症状，树势衰弱，产量下降，果实品质变劣，很快失去经济价值。目前，中国19个柑橘生产省(市、自治区)中已有11个受到该病危害，受害面积占柑橘总栽培面积的80％以上，产量占总产量的85％左右严重制约柑橘产业的健康发展。

柑橘黄龙病病菌明确的传播方式主要有带病接穗和通过带菌柑橘木虱取食，亦有报道称菟丝子可以进行传播；尚未明确种子是否能够传菌，也不明确有无其他传播途径，木虱、土壤、种植环境对其传播和流行的影响也无系统的研究；第二，柑橘种苗接穗、出苗周期短，检测需求集中，有很强的时效性，目前常规的核酸检测方法很难满足现有的检测需求。

目前柑橘黄龙病无法进行人工培养，而传统的指示植物、电镜、血清学等诊断方法，耗时耗力，且效率低下，因此国际上通常采用常规PCR\巢式PCR、实时荧光PCR等分子生物学技术来进行诊断。

1、聚合酶链式反应法(PCR)

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)利用基因组DNA或者cDNA在95℃高温下发生变性由双链变成单链，60℃左右时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，72℃左右时DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。PCR检测方法以其快速、准确和灵敏的特点受到广泛应用。

2、实时荧光定量PCR法

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法，通过内参对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光PCR技术已经用于柑橘黄龙病亚洲种的定量检测。

3、环介导等温扩增(LAMP)

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种快速核酸扩增方法是一种快速核酸扩增方法，该方法针对靶基因序列的6个不同区域设计4种特异性LAMP引物，利用一种链置换活性的Bst DNA聚合酶在等温条件(65℃左右)孵育30～60min，即可完成核酸扩增反应，黄丽等人通过该技术检测柑橘黄龙病亚洲种。

综上所述，采用PCR技术，具有快速、特异性强、灵敏度高的优点，是目前国内外筛检柑橘黄龙病亚洲种的重要手段，但需昂贵仪器，装备精良的实验室和专业的操作人员。LAMP法不需要昂贵的PCR仪，等温灵敏、特异性强、操作简单且易于观察结果，但是LAMP技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，较难在基层实验室推广应用。

发明内容

针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种柑橘黄龙病病菌亚洲种RAA荧光法检测试剂盒及其制备与应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：