[发明专利]一种牛源性成分的LAMP检测引物组、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种牛源性成分的LAMP检测引物组及检测方法。该方法包括以下步骤：1)设计合成引物；所述引物由上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3组成，所述引物的碱基序列如SEQ ID No：1～4；2)制备牛属北美野牛、奶牛、牦牛、水牛的DNA稀释液；3)配制LAMP反应体系并设定反应条件；4)进行LAMP方法特异性检测；5)进行LAMP方法灵敏度检测；6)通过电泳是否有梯形条带来确定待检样品是否属于牛源性。本发明建立的方法具有快速、高效、灵敏、准确等优点，在动物源性成分食品监管和检验检疫工作中有实际应用价值，尤其适用于基层实验室和现场检测的推广和应用。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及动物源性成分特异性的检测方法，具体涉及 一种牛源性成分的LAMP检测引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

动物源性成分的鉴定方法主要包括蛋白质鉴定(放射免疫法、色谱法等)和分子生物学鉴定(PCR方法等)两大类。应用蛋白质鉴定方法时，当肉类经过切碎、蒸煮、熏 烤等加工过程后，肉中蛋白质结构通常被破坏，物种特有的蛋白质或抗原决定部位也遭 到破坏。所以，通过蛋白质鉴定方法鉴别肉类品种的可靠性较差。相比之下，检测DNA 的鉴定方法更可靠，因为DNA在所有组织细胞中都一样，不用考虑DNA是从肌肉、 脂肪还是其他组织中提取的。由于分子生物学鉴定中的PCR法反应时间短，具有较高 的灵敏度、特异性和可操作性，目前已成为肉制品种属鉴别最常用的方法，但普通PCR 法扩增后需要凝胶电泳进行结果分析，所用染液EB为强致癌物质，因此存在一定的操 作安全隐患，并且还存在非特异性扩增导致的假阳性问题。常规的动物源性成分的检测 主要采用普通PCR方法和TaqMan实时荧光定量PCR方法。普通PCR方法由于操作繁 琐、耗时长、易污染环境等缺点已逐渐被TaqMan实时荧光定量PCR取代。TaqMan实 时荧光定量PCR灵敏度高、特异性好，但需昂贵的荧光PCR仪和配套的试剂，不能普 遍适用于检验检疫一线的基层实验室和现场检测。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本学者Notomi研发的基因诊断技术，该方法针对目的基因的6个区段设计引物，提高了检测的特异性，同时该方法的扩增效率较普通PCR高，很大程度地提高了灵敏度。因此可 以应用该技术尝试实现多靶标的动物源性成分的现场快速检测，而不需要依赖额外复杂 的实验设备及其他条件，有很大的实际应用前景。

LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点，现已应用 于致病微生物、病毒、寄生虫的鉴定，转基因和动物源成分检测等多方面。目前对于这 一技术的运用有对于微生物病原体的检验上，如大肠杆菌、沙门氏菌、分支杆菌、口蹄 疫病毒等。Denschlag等人用该技术检测了致突镰刀菌的Hyd5，Qingchao Li等验证了应 用LAMP技术转基因水稻中的cry1Ab基因优于qPCR方法，刘少宁等建立了一种能够 快速区分出绵羊肉中掺入狐狸源性成分的环介导等温扩增方法，徐淑菲等根据羊cytB 基因设计特异性引物，动物GenieⅡ等温扩增荧光检测系统，建立了检测羊源性成分的 LAMP方法。目前关于动物源性成分LAMP检测技术的应用多数是针对单靶标检测的， 且大部分方法是基于线粒体DNA靶序列的，而同一细胞中线粒体的拷贝数不定，该技 术的高灵敏度可能会导致无论反应工作与否都得到阳性结果，因此有必要建立基于牛属 共有基因组DNA序列的LAMP检测方法。

但是，目前依然尚无基于牛核基因组DNA序列的LAMP方法，用于检测牛源性成 分的报道或者专利。因此有必要建立针对牛核基因组DNA序列的牛源性成分的LAMP 检测技术。