[发明专利]新型溶菌酶荧光传感器的制备方法及其应用

说明书

本发明公开新型溶菌酶荧光传感器的制备方法及其应用，包括如下步骤：(1)碳量子点的制备及纯化；(2)溶菌酶分子印迹聚合物的制备。本申请以CQDs为荧光信号，LYZ为模板分子，NIPAAM为温敏单体，MAA、HEMA为辅助单体，MBA为交联剂，APS为引发剂，以及TEMED为催化剂，合成了对模板分子LYZ有特异性识别能力的分子印迹水凝胶荧光传感器。

技术领域

本发明涉及溶菌酶检测技术领域。具体地说是新型溶菌酶荧光传感器的制备方法。

背景技术

溶菌酶(LYZ)是临床诊断一些疾病的重要指标：结核性脑膜炎、神经梅毒和真菌性脑膜炎患者的脑脊液中LYZ浓度会显著升高；白血病和一些肾脏疾病患者的血清和尿液中LYZ活性也会发生变化。此外，LYZ还可以用作一些抗生素的有效替代品，甚至可以用于艾滋病等一些感染和溃疡类疾病的治疗。因此，在实际的生产生活中，将LYZ从实际生物样品的复杂基质中快速、有效且简便地检测出来是一件十分有意义的事情。现有较为常见的LYZ的检测方法有：高效液相色谱法、毛细管电泳法、酶联免疫吸附法、紫外分光光度法、荧光探针法等。上述的方法普遍存在仪器成本高，要求样品纯净，操作步骤繁琐等缺点，并且实际检测时样品中难免存在高丰度蛋白等干扰物质，极易影响上述方法的选择性。因此，急需找到一种高选择性、操作便捷、成本适中的检测方法。

分子印迹技术是通过仿生原理对特定的分子进行检测，因此，该技术具有优良的特异识别性和灵敏性，尤其是在极为复杂的样品中。分子印迹聚合物(MolecularlyImprinted Polymer,MIP)的合成一般需要三个步骤：首先，模板分子与功能单体通过共价键或非共价键作用进行组装；接着加入引发剂，通过功能单体和交联剂聚合，生成固定的高聚物体系；最后利用洗脱剂将模板分子从聚合物中洗脱出来，得到即与模板分子相匹配、具有多重作用点的空穴，进而在后续的检测中可以对模板分子进行精准识别。在实际检测中，MIP中的空穴会通过形状匹配和官能团间的静电作用(包括络合作用)、氢键作用、疏水作用等相互作用，实现对模板分子的选择性吸附。因此，可以形象的用“锁钥原理”来描述MIP的工作原理。

早在1972年，Wulff和Sarhan就发表了关于分子印迹的报道，分子印迹是现存的分子识别最常见的方法之一，它可以快速、灵敏和选择性地识别和检测目标分子。相比于自然界中的分子识别方法，分子印迹方法有低成本、高识别能力和长期耐用性等优异的特点，并且应用广泛，可以用于色谱、载药、固相萃取和传感技术等领域。在实际研究和生产中，分子印迹技术已经在多方面的得到应用。在小分子印迹方面，Kochaporn Chullasat课题组利用分子印迹聚合物，构建了一种光致发光探针，该方法重复性好，相对标准偏差小于6％，可以成功地用于实际样品中阿莫西林的测定，回收率为85-102％，实现了对痕量阿莫西林的有效分析。同样是抗生素分析，高敏君团队成功制备了能够特异性识别红霉素的分子印迹二维光子晶体水凝胶，该方法具有高选择性和可重复性的特点，有望用于红霉素的低成本简易检测中。除了抗生素以外，MIP在人工染料的特异性检测方面也表现出了非常优异的潜力。苏晓濛团队通过将罗丹明B作为模板分子，成功制备了具有高特异性和识别能力的MIP，该方法可以作为固相萃取材料，回收率在78.47-101.6％之间，相对标准偏差2％，有望用于检测食品中非法添加的罗丹明B。

从以上各例中不难看出，分子印迹技术应用十分广泛。但是传统的分子印迹技术还存在着一些亟待解决的问题和不容忽视的缺陷：传统分子印迹技术难免存在因吸附后检测时需要离心、操作过程繁琐复杂等缺点，而且MIP制备过程中所使用的模板分子一般以小分子化合物为主，而对于蛋白质、病毒、细胞等生物大分子的印迹进展依然缓慢。此外，将分子印迹技术与在线荧光检测结合，实现分子印迹的高选择性和荧光检测的高灵敏度兼顾成为现今分子印迹技术发展的重要趋势，也是目前分子印迹技术研究的热门领域。