[发明专利]一种脐带间充质干细胞共培养自然杀伤细胞的方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞共培养自然杀伤细胞的方法，其特征在于：该方法利用与脐带血供者相同来源的脐带间充质干细胞与脐带血中的有核细胞进行共培养，为脐带血中的有核细胞提供一个促进增殖和分化的微环境，实现脐带血中的有核细胞向NK细胞及其前体细胞在体外的大规模扩增，降低后续NK细胞大规模生产中对脐带血原料的需求应用于后续NK细胞治疗产品的产业化。

2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞共培养自然杀伤细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)脐带血有核细胞的分离与冻存；

(2)同一供者的脐带间充质制备与冻存；

(3)脐带血有核细胞与脐带间充质干细胞的共培养体外扩增；

(4)扩增后的脐带血有核细胞NK细胞分选；

(5)纯化NK细胞的体外大规模扩增与冻存。

3.根据权利要求2所述的一种脐带间充质干细胞共培养自然杀伤细胞的方法，其特征在于：所述脐带血有核细胞的分离与冻存包括以下步骤：

(1)从医院获取正常分娩的新生儿脐带和脐带血，脐带血的采集用含血液保存液的200ml一次性采血袋；

(2)采集的保证无菌的环境和操作，采集前确认新生儿的生物学母亲和生物学父亲供者无传染病风险，包括但不限于以下传染病：乙肝、丙肝、梅毒、HIV，其采集过程中无细菌，真菌，支原体污染；

(3)将采集的将脐血混匀后转移到250ml离心瓶内，加入1/4量的6％羟乙基淀粉氯化钠注射液，充分混匀后悬挂于超净台内，放置45min；

(4)吸取上层全部富含有核细胞的悬液并取样计数有核细胞数量和活率，于4℃1500rpm/min离心8min，按照计数结果去除多余的离心上清调整细胞悬液体积；

(5)调整细胞密度至1*10^6cells/ml，如细胞离心上清的体积不足则补充按照6％羟乙基淀粉氯化钠注射液对应的体积；

(6)重悬后的细胞按照细胞悬液：DMSO＝9:1的体积比加入DMSO后按照每批次生产1.2*10^7cells进行分装至5ml冻存管内；

(7)将完成分装的细胞依次置于4℃30min,-20℃2h和-80℃12h完成程序降温，后续的细胞置于气相液氮罐中长期保存。

4.根据权利要求2所述的一种脐带间充质干细胞共培养自然杀伤细胞的方法，其特征在于：所述同一供者的脐带间充质制备与冻存包括以下步骤：

(1)取脐带血相同供者新生儿来源无菌条件下采集的足月婴儿脐带10-20cm,生理盐水冲洗至表面无血液成分残留，去除表面羊膜、两条脐动脉血管和一条脐静脉血管后剪碎，组织块加入含有1％双抗的间充质干细胞无血清完全培养基后加入细胞培养瓶内与37℃、饱和湿度和5％CO2环境下培养；

(2)所述的间充质干细胞无血清完全培养基为完成配制的StemRD Mgro-500MesenGro人间充质干细胞无血清培养基；

(3)培养的前3周期间每隔5天更换一半新鲜的含有双抗的无血清完全培养基，待细胞融合度达70％-80％时，0.25％的胰蛋白酶消化细胞后用100μm细胞滤器过滤细胞并用生理盐水刷洗后离心回收细胞；

(4)回收的人脐带间充质干细胞重悬于不含双抗的无血清完全培养基加入T175细胞培养瓶中于37℃、饱和湿度和5％CO2环境下培养；

(5)待每代次细胞融合度达90％时，0.25％的胰蛋白酶消化细胞并用生理盐水刷洗后1100rpm离心5分钟回收细胞，该批次细胞按照1瓶传3瓶的比例悬浮于无血清完全培养基接种于T175后连续扩增1-5代，期间细胞培养于37℃、饱和湿度、5％CO2的环境中；

(6)传代扩增至P5代细胞融合度达90％时，0.25％的胰蛋白酶消化细胞并用生理盐水刷洗后1100rpm离心5分钟回收细胞，回收的细胞用DMEM重悬计数后1100rpm离心5分钟收集细胞沉淀，按照计数结果调整细胞密度至1*10^7cells/ml用间充质干细胞冻存液重悬浮；

(7)所述的间充质干细胞冻存液配方为DMEM基础培养基：胎牛血清：DMSO＝6:3:1，重悬后的细胞悬液按照1.2*10^8cells的总数分装于5ml冻存管内；

(8)将完成分装的细胞依次置于4℃30min,-20℃2h和-80℃12h完成程序降温，后续的细胞置于气相液氮罐中长期保存。