[发明专利]一种利用MK-5108阻断AURKA来减轻肾纤维化的方法

权利要求书

1.一种利用MK-5108阻断AURKA来减轻肾纤维化的方法，其特征在于，包括肾脏组织病理学分析、免疫组织化学分析、细胞培养研究、细胞增殖和细胞毒性测定、实时定量PCR检测、蛋白质测定、统计分析。

2.根据权利要求1所述的一种利用MK-5108阻断AURKA来减轻肾纤维化的方法，其特征在于，所述肾脏组织病理学分析具体包括如下步骤：

步骤1.1：将肾脏固定在4％多聚甲醛PFA中过夜，脱水并包埋在石蜡中，然后横向切成3μm切片；

步骤1.2：脱石蜡后，肾脏切片用Masson三色染色和Sirius红染色染色。

3.根据权利要求1所述的一种利用MK-5108阻断AURKA来减轻肾纤维化的方法，其特征在于，所述免疫组织化学分析具体包括如下步骤：

步骤2.1：将肾脏固定在4％多聚甲醛中，并包埋在石蜡中；

步骤2.2：将3微米厚的切片安装在载玻片上；

步骤2.3：将每个样品的载玻片脱蜡，并使用二甲苯和梯度乙醇按标准方法再水化；

步骤2.4：将这些切片在3％过氧化氢中孵育20分钟，在改良的柠檬酸盐抗原提取溶液中煮沸1分钟，然后冷却至室温；

步骤2.5：将玻片与抗AURKA(1：250)，PDGFR-β(1：200)，p-PDGFR-β(1：250)，α-SMA(1：10000)和单核细胞趋化蛋白1(MCP1)(1：250)的一抗在4℃孵育过夜；

步骤2.6：用磷酸盐缓冲盐水PBS洗涤后，应用生物素偶联的二抗，并使用DakoREAL^TMEnVision^TM检测系统K5007可视化信号。

4.根据权利要求1所述的一种利用MK-5108阻断AURKA来减轻肾纤维化的方法，其特征在于，所述细胞培养研究具体包括如下步骤：

步骤3.1：将正常的大鼠肾成纤维细胞NRK-49F和小鼠肾近端肾小管上皮细胞mPTC在添加有10％FBS的细胞培养基中生长，并在37℃，5％CO2培养箱中培养；

步骤3.2：使用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA以60-80％汇合将细胞传代培养；

步骤3.3：让细胞在无血清培养基中饥饿6-8h，然后用MK-5108(200nM或400nM)预处理1h；

步骤3.4：然后将15ng/ml的重组人转化生长因子-β₁，TGF-β1添加到培养基中；

步骤3.5：在15ng/ml的重组人TGF-β₁刺激6-8小时后，用AURKA质粒转染的细胞；

步骤3.6：24小时后收集细胞进行qRT-PCR分析，或48小时后收集细胞进行WB分析。

5.根据权利要求1所述的一种利用MK-5108阻断AURKA来减轻肾纤维化的方法，其特征在于，所述细胞增殖和细胞毒性测定具体步骤如下：

步骤4.1：细胞活力通过CCK-8测定试剂盒确定；

步骤4.2：将NRK-49F和mPTCs以10⁴-10⁵个细胞/孔的密度接种在100μL培养基中的孔板上，并用0-1000nM的各种浓度的MK-5108处理；

步骤4.3：温育24小时后，将每孔CCK-8试剂10μL加入培养基中，温育1-4小时；

步骤4.4：使用酶标仪在450nm处检测吸光度。