[发明专利]一种偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大肠杆菌工程菌的构建方法

权利要求书

1.一种偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大肠杆菌工程菌的构建方法；其特征是，包括如下步骤：

(1)从E.coli MG1655中敲除ptsG基因得到菌株ECΔp；

(2)从菌株ECΔp中敲除manZ基因得到菌株ECΔp-m；

(3)从菌株ECΔp-m中敲除atpFH基因得到菌株ECΔp-m-a；

(4)从菌株ECΔp-m-a中敲除envR基因得到菌株ECΔp-m-a-e。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是，ptsG基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1；manZ基因核苷酸序列为SEQ ID No.2；atpFH基因核苷酸序列为SEQ ID No.3；envR基因核苷酸序列为SEQ ID No.4。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是，基因敲除是基于λ-red和I-SceI的基因组无痕操作技术；具体敲除步骤如下：

(1)以E.coli MG1655菌株基因组为模板，分别扩增出目的基因上下游同源臂片段A和片段B；

(2)以pTKS/CS质粒为模板，分别扩增四环素抗性基因tet上游片段tet1和下游片段tet2；

(3)再以片段A、tet1为模板，进行重叠延伸PCR扩增出片段A-tet1，同样以片段tet2、B为模板，进行重叠延伸PCR扩增出片段tet2-B；

(4)再次进行重叠延伸PCR，以A-tet1和tet2-B为扩增模板，扩增出敲除片段A-t-B；

(5)敲除片段A-t-B经电击转化法转入大肠杆菌；

(6)弹出四环素抗性及缺失pKTRed质粒，经两次筛选后得到目的基因敲除菌株。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是，pTKS/CS质粒为SEQ ID No.5所示核苷酸序列；四环素抗性基因tet为SEQ ID No.6所示核苷酸序列；上游片段tet1核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示；下游片段tet2基因核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；pKTRed质粒核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

5.如权利要求3所述的方法，其特征是，所述步骤1)中ptsG基因敲除引物序列如下：

ptsG-Af：TGGCTGTGTTGAAAGGTGTTGCCG

ptsG-Ar：TATCCCTAAGCACAATGCCTCTATTTAGTTAACGTTCTG

ptsG-Bf：AGGGTAATCAGAACGTTAACTAAATAGAGGCATTGTGCTAAAAACGAACAAATGGCAGAG

ptsG-Br：GTCTGCAAGGCGCTCAAGACG

ptsG-tetf1：CAGAACGTTAACTAAATAGAGGCATTGTGCTTAGGGATAACAGGGTAATATTTAC

ptsG-tetr1：GGTAAAGCGATCCCACCACCAGCC

ptsG-tetf2：GCGTGAAGTGGTTCGGTT

ptsG-tetr2：TCGTTTTTAGCACAATGCCTCTATTTAGTTAACGTTCTGATTACCCTGTTATCCCTAC。