[发明专利]一种偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大肠杆菌工程菌的构建方法

说明书

本发明涉及一种偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大肠杆菌工程菌的构建方法；通过敲除野生型E.coli MG1655中的ptsG和manZ基因使其缓慢代谢葡萄糖同时优先利用木糖。通过敲除E.coli MG1655氧化磷酸过程中关键基因atpFH促进乙酸合成。通过敲除E.coli MG1655的envR基因促进E.coli分泌FFA到胞外。基因敲除工程菌利用木糖能够合成包括正己酸、正庚酸、正辛酸、正壬酸、正癸酸和正十二酸等六种FFA，在M9培养基中，以20g/L木糖为单碳源，能够合成5.5g/L乙酸和0.91g/L胞外FFA，与野生E.coli MG1655相比产量明显提高。

技术领域

本发明涉及一种偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大肠杆菌工程菌的构建方法，属于基因工程研究领域。

背景技术

随着社会的发展，能源需求、资源危机、粮食短缺等问题日益突出，促使人们寻找新型能源资源。地球上三分之一的陆地被植物覆盖，形成了大量的木质纤维素资源。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中半纤维素约占木质纤维素总量的20％～35％，其水解产物主要为木糖，使得木糖成为自然界中仅次于葡萄糖的第二多的糖类物质。在半纤维素水解研究愈发深入的基础上，木糖在农业、工业甚至科研中的应用也越来越广泛。

大肠杆菌(E.coli)是目前已被广泛研究的模式菌种之一，其基因背景清晰，遗传改造手段丰富，应被广泛应用于各种生物学研究。用于产生有价值化合物的重组菌株的优化是基因工程的主要目标。为此，已经设计了多种策略构建重组菌株，包括增加代谢前体的供应，缺失负调节剂，正调节剂的过表达以及去除前体消耗和产物降解途径。乙酸是一种非常有前景的碳源，已被当作有望降低PHA生产成本的底物之一。游离脂肪酸(free fattyacids，FFA)，是微生物利用脂肪酸合成通路中间代谢物Acyl-ACP为底物经硫酯酶(thioesterases)催化合成的一种游离型脂肪酸。近十几年间，理性代谢工程已经被广泛的应用于提高FFA及其前体的合成，但目前偏好利用木糖高产乙酸和FFA的工程菌株的构建还未见报道。

发明内容

本发明提出一种偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大肠杆菌工程菌的构建方法。

本发明通过敲除E.coli MG1655中ptsG和manZ基因使其缓慢代谢葡萄糖同时优先利用木糖。通过敲除E.coli MG1655氧化磷酸过程中关键基因atpFH促进乙酸合成。验证敲除ptsG和manZ基因对E.coli MG1655葡萄糖和木糖利用的影响。通过敲除E.coli MG1655的envR基因促进大肠杆菌分泌FFA到胞外。最终获得已敲除四个基因的工程菌ECΔp-m-a-e，进行FFA和乙酸生产测试。

本发明具体技术如下：

一种偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大肠杆菌工程菌的构建方法；通过敲除野生型E.coli MG1655中的ptsG和manZ基因使其缓慢代谢葡萄糖同时优先利用木糖；通过敲除E.coli MG1655氧化磷酸过程中关键基因atpFH促进乙酸合成；通过敲除E.coliMG1655的envR基因促进大肠杆菌分泌FFA到胞外；其具体步骤如下：

(1)从E.coli MG1655中敲除ptsG基因得到菌株ECΔp；

(2)从菌株ECΔp中敲除manZ基因得到菌株ECΔp-m；

(3)从菌株ECΔp-m中敲除atpFH基因得到菌株ECΔp-m-a；

(4)从菌株ECΔp-m-a中敲除envR基因得到菌株ECΔp-m-a-e；

所述步骤(1)中ptsG基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述步骤(2)中manZ基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述步骤(3)中atpFH基因核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述步骤(4)中envR基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。