[发明专利]基于等离子共振的血液D-二聚体定量检测方法

权利要求书

1.一种基于等离子共振的血液D-二聚体定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

第一步骤：准备无底孔板以及纳米光学传感器芯片；

第二步骤：制备纳米金颗粒，用于放大检测信号；

第三步骤：配制D-二聚体浓度标准样品，用于测量样品中的D-二聚体浓度；

第四步骤：配置反应缓冲液试剂作为第一试剂，然后用D-二聚体标记抗体标记纳米金颗粒，制成第二试剂；

第五步骤：向第一试剂中加入D-二聚体标准血液样品或血液待测样品，制备成混合溶液并加入到多孔微孔板中，其中多孔微孔板中配置有纳米光学传感器芯片；

第六步骤：向中多孔微孔板加入第二试剂，完成D-二聚体与标记纳米金颗粒复合物的捕获；

第七步骤：通过检测加入第二试剂前后580nm波长下的OD差值，实现D-二聚体定量检测。

2.根据权利要求1所述的基于等离子共振的血液D-二聚体定量检测方法，其特征在于，制备纳米光学传感器芯片采用复制成形工艺，其中利用激光干涉光刻在石英基板上制作锥形纳米柱图案，然后将紫外光固化聚合物NOA-61均匀散布在模具上，顶部以聚对苯二甲酸乙二醇酯支撑；用紫外光进行3分钟固化处理，然后将聚对苯二甲酸乙二醇酯基板连同周期性纳米孔道图案从模具上仔细剥除；通过电子束蒸发沉积形成一个钛粘附层和一个黄金层，以实现等离激元器件成形，然后利用射频等离子体溅射沉积二氧化钛谐振腔层，而后通过16nm钛粘附层和顶部黄金层的电子束蒸发形成纳米谐振腔。

3.根据权利要求2所述的基于等离子共振的血液D-二聚体定量检测方法，其特征在于，所述钛黏附层、黄金层和二氧化钛谐振腔层的厚度分别是16nm、220nm和180nm。

4.根据权利要求1所述的基于等离子共振的血液D-二聚体定量检测方法，其特征在于，制备粒径为13～15nm纳米金颗粒。

5.根据权利要求4所述的基于等离子共振的血液D-二聚体定量检测方法，其特征在于，制备纳米金颗粒的方法如下，在100ml去离子水中加入1ml 1％氯金酸溶液，加热至沸腾，然后再加入4mL 1％柠檬酸三钠溶液，继续加热并采用磁力搅拌器进行搅拌，溶液颜色会由黑色变至橙红色，待溶液颜色恒定，再加热15分钟后停止加热；静置，冷却至室温，得到Au纳米颗粒分散溶液，即最终的纳米金颗粒。

6.根据权利要求1所述的基于等离子共振的血液D-二聚体定量检测方法，其特征在于，配制D-二聚体浓度标准样品的方法如下，采用2μg/ml的D-二聚体蛋白溶液为母液，稀释配制为不同浓度梯度的D-二聚体标准样品溶液(1ng/ml～500g/ml)；稀释底液为PBS缓冲液；血液样本在凝血后，2000g离心10分钟后取上清，1：100至1：2000倍稀释后进行检测，稀释底液为PBS缓冲液。

7.根据权利要求1所述的基于等离子共振的血液D-二聚体定量检测方法，其特征在于，D-二聚体标记抗体标记纳米金颗粒的方法如下，用0.1M K2CO3溶液调节纳米金颗粒溶液pH至D-二聚体标记抗体的蛋白等电点，加入终浓度为6μg/ml的单克隆抗D-二聚体标记抗体，混匀，室温孵育30分钟，然后加入终浓度为1％的牛血清白蛋白阻断液，室温孵育10分钟；设置离心机转速为9000rpm/min，离心25分钟，去除上清，复溶至原溶液体积的1/4。

8.根据权利要求1所述的基于等离子共振的血液D-二聚体定量检测方法，其特征在于，D-二聚体蛋白与标记过的纳米金颗粒复合物的结合方法如下，将D-二聚体标记抗体标记过的纳米金颗粒复溶液混匀后，加入到含有D-二聚体样本的芯片孔板中，再将孔板放入酶标仪中震荡反应30分钟。

9.根据权利要求1所述的基于等离子共振的血液D-二聚体定量检测方法，其特征在于，检测加样前后580nm波长下的芯片孔OD值的方法如下，加样前，取出加入了含D-二聚体样本的芯片孔板，用酶标仪检测待测试孔在580nm波长下的OD₁值；待孔中加入第二试剂并且反应完毕后，得到检测试孔在580nm波长下的OD₂值，用加样前后的测试孔OD差值来表征D-二聚体与D-二聚体抗体间的接合量，由此实现D-二聚体定量检测。