[发明专利]基于等离子共振的血液D-二聚体定量检测方法

说明书

本发明公开了一种基于等离子共振的血液D‑二聚体定量检测方法，所述方法包括：准备无底孔板，制备纳米光学传感器芯片，用于产生等离光子谐振耦合效应的多孔微孔板；制备纳米金颗粒，用于放大检测信号；配制D‑二聚体浓度标准样品，用于测量样品中的D‑二聚体浓度；配置反应缓冲液试剂作为第一试剂，然后用D‑二聚体标记抗体标记纳米金颗粒，制成第二试剂；向第一试剂中加入D‑二聚体标准血液样品或血液待测样品，制备成混合溶液并加入到多孔微孔板中；加入第二试剂，完成D‑二聚体与标记纳米金颗粒复合物的捕获；通过检测加入第二试剂前后580nm波长下的OD差值，实现D‑二聚体定量检测。

技术领域

本发明实施例涉及检测技术领域，以D-二聚体(D-Dimer)为例利用 酶标仪及纳米金颗粒来进行定量检测的方法。

背景技术

分子相互作用动力学的测量在药物发现，遗传筛查和临床诊断中越来 越重要，因为动态结合信息可以提高对疾病的认识和可以为治疗提供新思 路。表面等离子体共振(SPR)传感器，如商业Biacore SPR生物传感器系 统，能够实时监测动力学生物分子相互作用，无需标记，不受大量背景的 影响。由于商业Biacore SPR生物传感器系统属于传统SPR设备，所以其 需要特制的设备，专人的操作，使得购买或使用该生物传感器系统需要大 量的金钱。

以D-二聚体作为示例蛋白是D-二聚体来源于纤溶酶溶解的交联纤维 蛋白凝块，主要反映纤维蛋白溶解功能。D-二聚体的临床检测主要应用在 静脉血栓栓塞(VTE)、深静脉血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)的诊断。 血液中有纤维蛋白，纤维蛋白经过活化和水解，产生特异的降解产物称为 “纤维蛋白降解产物。D-二聚体是最简单的纤维蛋白降解产物，D-二聚体 水平升高说明体内存在高凝状态和继发性的纤维蛋白溶解亢进。因此，D- 二聚体质量浓度对血栓性疾病的诊断、疗效评估和预后判断具有重要的意 义。

然而，现有的含量测定方法要么成本较高，要么精度不够高，或者测 定操作复杂。由此，希望能够提供一种操作简单且精度高的低成本方案。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种以D-二聚体为例利用酶标仪及纳米金颗 粒来进行定量检测的方法，以解决现有技术中存在上述缺陷，提供一种操 作简单且精度高、成本低的基于等离子共振的D-二聚体定量检测方法。

一种以D-二聚体(D-Dimer)为例利用酶标仪、nanoSPR芯片以及纳 米金颗粒来进行定量检测的方法，所述方法包括以下步骤：自制打印无底 孔板(例如96孔板)，制备纳米光学传感器芯片(PORT芯片)，用于产生 等离光子谐振耦合效应的设备；制备纳米金颗粒，用于放大检测信号；配 置反应缓冲液试剂作为第一试剂，然后用D-二聚体标记抗体标记纳米金颗 粒，制成第二试剂；向第一试剂中加入D-二聚体标准血液样品或血液待测 样品，制备成混合溶液并加入到多孔微孔板中；加入第二试剂，完成D- 二聚体与标记纳米金颗粒复合物的捕获；通过检测加入第二试剂前后 580nm波长下的OD差值，实现D-二聚体定量检测。

具体优选地，制备纳米光学传感器芯片采用复制成形工艺。

具体优选地，制备纳米光学传感器芯片方法如下，利用激光干涉光刻 在石英基板上制作锥形纳米柱图案，然后将紫外光固化聚合物(NOA-61， Sigma)均匀散布在模具上，顶部以聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)支撑； 用紫外光进行3分钟固化处理，然后将聚对苯二甲酸乙二醇酯基板连同周 期性纳米孔道图案从模具上仔细剥除；通过电子束蒸发沉积形成一个钛 (Ti)粘附层和一个黄金层，以实现等离激元器件成形，然后利用射频等 离子体溅射沉积二氧化钛谐振腔层，而后通过16nm钛粘附层和顶部黄金 层的电子束蒸发形成纳米谐振腔。

具体优选地，所述钛黏附层、黄金层和二氧化钛谐振腔层的厚度分别 是16nm、220nm和180nm。

具体优选地，制备粒径为13～15nm纳米金颗粒。