[发明专利]一种降解岩藻多糖噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种降解岩藻多糖的噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用，属于酶制备技术领域。所述制备方法具体包括：利用能够产生富含岩藻糖胞外多糖的宿主肠杆菌富集培养噬菌体，制备得到噬菌体富集液，采用超滤法从噬菌体富集液中分离噬菌体源多糖解聚酶酶液，并利用丙酮沉淀法进一步纯化酶液得到噬菌体源多糖解聚酶(Pb‑glyE1)。本发明得到的Pb‑glyE1酶活稳定，能够降解包括褐藻岩藻多糖和海参岩藻多糖等多种岩藻多糖。本发明提供了一种新型噬菌体源多糖解聚酶的制备方法，产物酶活稳定且制备工艺简单易放大。此外为降解大分子岩藻多糖提供了有效的酶工具，有利于岩藻寡糖的产业化制备。

技术领域

本发明涉及酶制备技术领域，特别是涉及一种降解岩藻多糖噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用。

背景技术

岩藻多糖是一类来自于海洋藻类或者无脊椎动物的硫酸化多糖，具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤和抗氧化等活性功能。岩藻多糖由于存在分子量大，组成复杂，吸收性差等问题而限制了其在医药、食品和化妆品领域的应用。将大分子量岩藻多糖降解成小分子量岩藻寡糖可以有效提高岩藻多糖利用率和利用价值并拓展岩藻多糖的应用空间。

目前常用于降解岩藻多糖的方法主要是化学法，包括酸解法和氧化法。化学法具有生产条件严苛、产物聚合度不一、纯化难度大，得率低的特点而未在工业上广泛应用。酶解法降解岩藻多糖是一种高效、温和的方法，同时还可以保护多糖侧链基团不被破坏。噬菌体在侵染能够产生胞外多糖的宿主菌时可以产生一种降解酶——噬菌体源多糖解聚酶，它能够降解细菌表面胞外多糖，并通过攻击糖苷键来释放多糖重复单元。噬菌体源多糖解聚酶具有可控性高、制备重复性好、污染小、降解条件温和等优点，因而在酶解多糖应用上有一定的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种降解岩藻多糖的噬菌体源多糖解聚酶的制备方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题。在本方法中，从污水中筛选出肠杆菌的噬菌体，并从噬菌体中分离制备噬菌体源多糖解聚酶(Pb-glyE1)，得到的Pb-glyE1制备方法简单、酶活稳定，产量高，并且能够有效降解褐藻岩藻多糖和海参岩藻多糖。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于降解多种岩藻多糖的噬菌体源多糖解聚酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)宿主细胞发酵液的制备：将宿主肠杆菌F-CE2接种于LB液体培养基中，37℃培养6～7h至对数生长期，获得肠杆菌发酵液备用；

(2)噬菌体培养液制备：利用产多糖解聚酶的噬菌体，经过纯化与富集，将效价达到10¹⁰～10¹²pfu/mL的噬菌体与步骤(1)中新鲜的肠杆菌发酵液按照体积比为1：10混合均匀，30～37℃培养3～12h，直至培养液OD₆₀₀值降低至0～0.2；所述产多糖解聚酶的噬菌体保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为No.19978，保藏日期为2020年7月14日，命名为PF-CE2；分类学为肠杆菌噬菌体(Enterobacter phage)；

(3)噬菌体源多糖解聚酶的收集：步骤(2)得到的培养液6000～8000r/min离心10min去除菌体碎片，上清液使用10kDa超滤膜超滤以收集分子量大于10kDa的粗酶液；

(4)噬菌体源多糖解聚酶的精制：在低温的环境下，将预冷的丙酮与步骤(3)得到的粗酶液按照1～3：1体积比缓慢混合均匀，随后过夜静置，6000～8000r/min离心10min收集沉淀，真空冷冻干燥，得到噬菌体源多糖解聚酶酶粉。

优选的，得到的噬菌体源多糖解聚酶在pH为3～9，25～65℃之间具有解聚酶活性，酶活为500～1000U。

优选的，步骤(2)中所述的噬菌体能够有效侵染宿主肠杆菌，在分类学上属于长尾科噬菌体。