[发明专利]一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法在审
申请号: | 202011445483.8 | 申请日: | 2020-12-09 |
公开(公告)号: | CN112501325A | 公开(公告)日: | 2021-03-16 |
发明(设计)人: | 那广水;张鸿;高会;李瑞婧;金帅辰;李西清;王璇;赵琨 | 申请(专利权)人: | 国家海洋环境监测中心;安徽微分基因科技有限公司 |
主分类号: | C12Q1/689 | 分类号: | C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/6806;C12N15/63 |
代理公司: | 安徽申策知识产权代理事务所(普通合伙) 34178 | 代理人: | 程艳梅 |
地址: | 116085 辽*** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 通量 水产 养殖 抗生素 抗性 基因 定量 检测 方法 | ||
1.一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法,包括四环素抗生素抗性基因,水产养殖环境样本的采集,处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理,其特征在于,
所述四环素抗生素抗性基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetH、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetW、tetX、tetBP等14种;
所述水产养殖环境样本包括水体、沉积物和水产品排泄物;
所述水产养殖环境样本的处理具体包括如下:
水体样本通过0.22-0.28μm混合滤膜过滤,然后将混合滤膜冷冻保存;
沉积物直接采集,然后冷冻保存;
水产品排泄物是采集水产品的肠道,然后冷冻保存;
所述高通量qPCR检测的平台为wafergen平台的smartchip qPCR仪,所述smartchipqPCR仪一次可运行5184个qPCR反应,有14种引物和样本搭配模式;定量检测方法为qPCR法;定量检测方法的100nL反应体系为:
1×LightCycler 480 SYBR Green IMaster
500nM each primer
DNA template 2ng/μL
所述定量检测方法的反应条件为:预变性95℃,10min;{95℃,30s;60℃,30s}40cycles+溶解曲线;
所述数据处理是通过python编写的自动化脚本计算每个样本的每个基因的绝对拷贝数。
2.根据权利要求1所述的一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法,其特征在于,所述四环素类抗生素抗性基因的引物序列如下:
3.根据权利要求1所述的一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法,其特征在于,14种所述标准品构建过程如下:
(1)通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段;
(2)切胶回收耐药基因的普通PCR产物;
(3)PCR产物一代测序,并与NCBI数据库比对,比对确定是相对应的基因再进行下一步;
(4)将回收的普通PCR产物与克隆载体连接成环状质粒,转化至感受态细菌进行克隆,通过质粒携带的抗性基因筛选出阳性克隆子,分离纯化后提取质粒;
(5)对质粒插入片段进行一带测序,跟(3)的序列进行比对,吻合后即为该基因的质粒标准品。
4.根据权利要求2所述的海水浴场中磺胺类抗生素抗性基因的定量检测方法,其特征在于,14种所述标准品分别用无核酸水按照1/10依次梯度稀释5个标准液,然后用smartchip qPCR绘制标准曲线。
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