[发明专利]一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法

权利要求书

1.一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法，包括四环素抗生素抗性基因，水产养殖环境样本的采集，处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理，其特征在于，

所述四环素抗生素抗性基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetH、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetW、tetX、tetBP等14种；

所述水产养殖环境样本包括水体、沉积物和水产品排泄物；

所述水产养殖环境样本的处理具体包括如下：

水体样本通过0.22-0.28μm混合滤膜过滤，然后将混合滤膜冷冻保存；

沉积物直接采集，然后冷冻保存；

水产品排泄物是采集水产品的肠道，然后冷冻保存；

所述高通量qPCR检测的平台为wafergen平台的smartchip qPCR仪，所述smartchipqPCR仪一次可运行5184个qPCR反应，有14种引物和样本搭配模式；定量检测方法为qPCR法；定量检测方法的100nL反应体系为：

1×LightCycler 480 SYBR Green IMaster

500nM each primer

DNA template 2ng/μL

所述定量检测方法的反应条件为：预变性95℃，10min；{95℃，30s；60℃，30s}40cycles+溶解曲线；

所述数据处理是通过python编写的自动化脚本计算每个样本的每个基因的绝对拷贝数。

2.根据权利要求1所述的一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于，所述四环素类抗生素抗性基因的引物序列如下：

3.根据权利要求1所述的一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于，14种所述标准品构建过程如下：

(1)通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段；

(2)切胶回收耐药基因的普通PCR产物；

(3)PCR产物一代测序，并与NCBI数据库比对，比对确定是相对应的基因再进行下一步；

(4)将回收的普通PCR产物与克隆载体连接成环状质粒，转化至感受态细菌进行克隆，通过质粒携带的抗性基因筛选出阳性克隆子，分离纯化后提取质粒；

(5)对质粒插入片段进行一带测序，跟(3)的序列进行比对，吻合后即为该基因的质粒标准品。

4.根据权利要求2所述的海水浴场中磺胺类抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于，14种所述标准品分别用无核酸水按照1/10依次梯度稀释5个标准液，然后用smartchip qPCR绘制标准曲线。