[发明专利]一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法在审

专利信息
申请号: 202011445483.8 申请日: 2020-12-09
公开(公告)号: CN112501325A 公开(公告)日: 2021-03-16
发明(设计)人: 那广水;张鸿;高会;李瑞婧;金帅辰;李西清;王璇;赵琨 申请(专利权)人: 国家海洋环境监测中心;安徽微分基因科技有限公司
主分类号: C12Q1/689 分类号: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/6806;C12N15/63
代理公司: 安徽申策知识产权代理事务所(普通合伙) 34178 代理人: 程艳梅
地址: 116085 辽*** 国省代码: 辽宁;21
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要:
搜索关键词: 一种 通量 水产 养殖 抗生素 抗性 基因 定量 检测 方法
【权利要求书】:

1.一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法,包括四环素抗生素抗性基因,水产养殖环境样本的采集,处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理,其特征在于,

所述四环素抗生素抗性基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetH、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetW、tetX、tetBP等14种;

所述水产养殖环境样本包括水体、沉积物和水产品排泄物;

所述水产养殖环境样本的处理具体包括如下:

水体样本通过0.22-0.28μm混合滤膜过滤,然后将混合滤膜冷冻保存;

沉积物直接采集,然后冷冻保存;

水产品排泄物是采集水产品的肠道,然后冷冻保存;

所述高通量qPCR检测的平台为wafergen平台的smartchip qPCR仪,所述smartchipqPCR仪一次可运行5184个qPCR反应,有14种引物和样本搭配模式;定量检测方法为qPCR法;定量检测方法的100nL反应体系为:

1×LightCycler 480 SYBR Green IMaster

500nM each primer

DNA template 2ng/μL

所述定量检测方法的反应条件为:预变性95℃,10min;{95℃,30s;60℃,30s}40cycles+溶解曲线;

所述数据处理是通过python编写的自动化脚本计算每个样本的每个基因的绝对拷贝数。

2.根据权利要求1所述的一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法,其特征在于,所述四环素类抗生素抗性基因的引物序列如下:

3.根据权利要求1所述的一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法,其特征在于,14种所述标准品构建过程如下:

(1)通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段;

(2)切胶回收耐药基因的普通PCR产物;

(3)PCR产物一代测序,并与NCBI数据库比对,比对确定是相对应的基因再进行下一步;

(4)将回收的普通PCR产物与克隆载体连接成环状质粒,转化至感受态细菌进行克隆,通过质粒携带的抗性基因筛选出阳性克隆子,分离纯化后提取质粒;

(5)对质粒插入片段进行一带测序,跟(3)的序列进行比对,吻合后即为该基因的质粒标准品。

4.根据权利要求2所述的海水浴场中磺胺类抗生素抗性基因的定量检测方法,其特征在于,14种所述标准品分别用无核酸水按照1/10依次梯度稀释5个标准液,然后用smartchip qPCR绘制标准曲线。

下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于国家海洋环境监测中心;安徽微分基因科技有限公司,未经国家海洋环境监测中心;安徽微分基因科技有限公司许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/202011445483.8/1.html,转载请声明来源钻瓜专利网。

×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top