[发明专利]一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法

说明书

一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法，包括水产养殖样本的采集，处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理，四环素抗生素抗性基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetH、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetW、tetX、tetBP等14种；14种标准品构建过程：(1)通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段；(2)切胶回收耐药基因的普通PCR产物；(3)PCR产物一代测序，并与NCBI数据库比对，比对确定是相对应的基因再进行下一步；(4)将回收的普通PCR产物与克隆载体连接成环状质粒，转化至感受态细菌进行克隆，通过质粒携带的抗性基因筛选出阳性克隆子，分离纯化后提取质粒；(5)对质粒插入片段进行一带测序，跟(3)的序列进行比对，吻合即为该基因的质粒标准品。

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法。

背景技术

随着水产养殖产业的飞速发展，抗生素作为治疗和控制疾病暴发重要手段，被作为养殖药物或者混合饲料被大量投入使用。不仅降低了抗生素的效用，还促进水产养殖环境和水产品体内产生抗性细菌及抗生素抗性基因，目前，水产养殖环境已被证实是抗生素抗性基因的重要储库。其中，四环素类抗生素作为一类具有广谱抗菌活性的人畜共用抗菌剂，被广泛用于水产养殖环境。四环素类抗性基因在水产养殖环境具有极高检出率，并且亚型最为丰富。水产养殖环境中抗生素抗性污染的传播、扩散往往可能比抗生素本身的危害更大，可通过食物链给人类健康带来更为直接的危害，建立水产养殖环境中典型抗生素抗性基因的分析检测手段势在必行。但抗生素抗性基因关注较少，目前尚未建立统一的检测方法来测定水产养殖环境中的抗生素抗性基因。但是要实现水产养殖环境的全方位的监测，对于通量要求比较高。而且开放的水产养殖环境核酸提取量比较少，所以迫切需要一种技术及能高通量的监测，又对样本的总量要求比较低的一种技术和方法。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供了一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法，包括水产养殖环境样本的采集，处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理，其特征在于，所述四环素抗生素抗性基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetH、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetW、tetX、tetBP等14种；所述水产养殖环境样本包括水体、沉积物和水产品排泄物；所述水产养殖环境样本的处理具体包括如下：水体样本通过0.22-0.28μm混合滤膜过滤，然后将混合滤膜冷冻保存；沉积物直接采集，然后冷冻保存；水产品排泄物是采集水产品的肠道，然后冷冻保存；

优选的，所述高通量qPCR检测的平台为wafergen平台的smartchip qPCR仪，所述smartchip qPCR仪一次可运行5184个qPCR反应，有14种引物和样本搭配模式；所述定量检测方法为qPCR法；所述定量检测方法的100nL反应体系为：

1×LightCycler 480SYBR Green IMaster

500nM each primer

DNA template 2ng/μL

优选的，所述定量检测方法的反应条件为：预变性95℃，10min；{95℃，30s；60℃，30s}40cycles+溶解曲线；

优选的，所述数据处理是通过python编写的自动化脚本计算每个样本的每个基因的绝对拷贝数；

优选的，所述四环素类抗生素抗性基因的引物序列如下：

优选的，14种所述标准品构建过程如下：