[发明专利]一种重组MARC-145细胞及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组MARC‑145细胞及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明公开的一种重组MARC‑145细胞，是在MARC‑145细胞中同时表达猪源CD163和唾液酸结合Ig样凝集素10基因的MARC‑145^{pCD163‑pSiglec10}细胞系。本发明构建的MARC‑145^{pCD163‑pSiglec10}细胞系，能够快速地增殖PRRSV，为PRRSV疫苗开发和相关研究奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组MARC-145细胞及其构建方法和应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)引起的一种全球性的猪的病毒性传染病，主要以母猪繁殖障碍及仔猪严重的呼吸道疾病为主要特征，成为危害我国养猪业最严重的疾病之一。给中国的养猪业造成了巨大的经济损失。

PRRSV具有相当严格的细胞嗜性，在猪源细胞中，原代猪肺泡巨噬细胞(PAMs)是其主要宿主细胞，除此之外PRRSV在体外主要感染猴肾细胞MA-104及其衍生的细胞系，如非洲绿猴的肾细胞系Marc-145细胞。研究表明PRRSV的细胞嗜性主要由细胞上病毒的受体所决定。目前已鉴定出存在于PAM细胞上的PRRSV受体有三个：硫酸乙酰肝素(HS)、唾液酸粘附素(Siglec-1，CD169)和CD163等。在自然宿主细胞PAM上，已经确定的PRRSV的受体有三个：硫酸乙酰肝素，Siglec-1和CD163。硫酸乙酰肝素主要是吸附病毒粒子，而Siglec-1既可以吸附病毒又可以介导病毒的内吞，而且这种内吞作用是不依赖硫酸乙酰肝素的。此外，CD163可能协助Siglec-1内吞，病毒脱衣壳和将基因组RNA释放到细胞质中的作用，因此Siglec-1和CDl63分子在介导RRSV进入PAM的过程中具有协同作用。Siglec-10是一种与Siglec-1属于同一家族的唾液酸结合蛋白，最新研究表明Siglec-10也参与PRRSV的胞吞作用，在PRRSV进入细胞过程中发挥重要作用。目前用于分离PRRSV的细胞系是传代细胞系非洲绿猴的肾细胞系Marc-145细胞，但是Marc-145只表达CD163受体，而不表达Siglec-10受体，导致目前部分PRRSV无法在Marc-145细胞上分离。由于最容易感染、分离PRRSV的PAMS只能原代培养，制作过程麻烦，成本高昂且易被其他微生物污染，而目前常用的MARC-145细胞虽然可以增殖PRRSV，但来源于猴，其受限于自然宿主，同时存在着PRRSV增殖速度慢、滴度低的局限性。基于此，建立一种猪源细胞用于PRRSV的分离培养及相关研究成为当务之急。

因此，提供一种重组MARC-145细胞及其构建方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种同时表达猪源CD163和唾液酸结合Ig样凝集素10(Siglec-10)基因的重组MARC-145细胞及其构建方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组MARC-145细胞，是在MARC-145细胞中同时表达猪源CD163和唾液酸结合Ig样凝集素10基因的MARC-145^{pCD163-pSiglec10}细胞系。

进一步，所述的一种重组MARC-145细胞的构建方法，具体步骤如下：

(1)PCR分别扩增pCD163、pSiglec-10基因；

(2)分别构建pLVX-pCD163-PGK-Puro和pCDNA3.1-Siglec-10重组质粒；

(3)慢病毒包装：将重组质粒pLVX-pCD163-PGK-Puro以及系统包装质粒一起导入293T细胞，获得rLV-pCD163；