[发明专利]一种基于高通量水产养殖环境中基因盒的定量检测方法在审
| 申请号： | 202011447764.7 | 申请日： | 2020-12-09 |
| 公开（公告）号： | CN112592990A | 公开（公告）日： | 2021-04-02 |
| 发明（设计）人： | 那广水;张鸿;高会;李瑞婧;金帅辰;李西清;王璇;赵琨 | 申请（专利权）人： | 国家海洋环境监测中心;安徽微分基因科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/6806;C12N15/63 |
| 代理公司： | 安徽申策知识产权代理事务所(普通合伙) 34178 | 代理人： | 程艳梅 |
| 地址： | 116085 辽*** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 通量 水产 养殖 环境 基因 定量 检测 方法 | ||
1.一种基于高通量水产养殖环境中基因盒的定量检测方法，包括基因盒，水产养殖环境样本的采集，处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理，其特征在于，
所述基因盒包括整合子、磺胺类抗生素抗性基因、β-内酰胺类抗生素抗性基因、氯霉素类抗生素抗性基因；
所述整合子包括int1、int2两个基因；
所述磺胺类抗生素抗性基因包括sul1、sul2、sul3三个基因；
所述β-内酰胺类抗生素抗性基因包括blaTEM、blaSHV、blaPSE-1三个基因；
所述氯霉素类抗生素抗性基因包括floR、cmlA两个基因；
所述基因盒包含10个基因；
所述水产养殖环境样本包括水体、沉积物和水产品排泄物；
所述水产养殖环境样本的处理具体包括如下：
水体样本通过0.22-0.28μm混合滤膜过滤，然后将混合滤膜冷冻保存；
沉积物直接采集，然后冷冻保存；
水产品排泄物是采集水产品的肠道，然后冷冻保存；
所述高通量qPCR检测的平台为wafergen平台的smartchip qPCR仪，所述smartchipqPCR仪一次可运行5184个qPCR反应，有14种引物和样本搭配模式；所述定量检测方法为qPCR法；所述定量检测方法的100nL反应体系为：
1×LightCycler 480SYBR Green IMaster
500nM each primer
DNA template 2ng/μL
所述定量检测方法的反应条件为：预变性95℃，10min；{95℃，30s；60℃，30s}40cycles+溶解曲线；
所述数据处理是通过python编写的自动化脚本计算每个样本的每个基因的绝对拷贝数。
2.根据权利要求1所述的一种基于高通量水产养殖环境中基因盒的定量检测方法，其特征在于，所述基因盒的引物序列如下：
名称 上游引物 下游引物 int1 GGCTTCGTGATGCCTGCTT CATTCCTGGCCGTGGTTCT int2 GTTATTTTATTGCTGGGATTAGGC TTTTACGCTGCTGTATGGTGC sul1 CAGCGCTATGCGCTCAAG ATCCCGCTGCGCTGAGT sul2 TCATCTGCCAAACTCGTCGTTA GTCAAAGAACGCCGCAATGT sul3 TCCGTTCAGCGAATTGGTGCAG TTCGTTCACGCCTTACACCAGC blaTEM AGCATCTTACGGATGGCATGA TCCTCCGATCGTTGTCAGAAGT blaSHV TTATCTCCCTGTTAGCCACC GATTTGCTGATTTCGCTCGG blaPSE-1 TGCTTCGCAACTATGACTAC AGCCTGTGTTTGAGCTAGAT floR ATTGTCTTCACGGTGTCCGTTA CCGCGATGTCGTCGAACT cmlA GTTGGCGGTACTCCCTTGCC GGCCACCTCCCAGTAGAACG
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