[发明专利]一种基于高通量水产养殖环境中基因盒的定量检测方法

说明书

一种基于高通量水产养殖环境中基因盒的定量检测方法，包括水产养殖环境样本的采集，处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理，所述基因盒包括整合子、磺胺类抗生素抗性基因、β‑内酰胺类抗生素抗性基因、氯霉素类抗生素抗性基因；所述整合子包括int1、int2两个基因；所述磺胺类抗生素抗性基因包括sul1、sul2、sul3三个基因；所述β‑内酰胺类抗生素抗性基因包括blaTEM、blaSHV、blaPSE‑1三个基因；所述氯霉素类抗生素抗性基因包括floR、cmlA两个基因；所述基因盒包含10个基因，本发明具有检测通量高的优点，对于10个基因盒相关基因，一次可检测384个样本。

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种基于高通量水产养殖环境中基因盒的定量检测方法。

背景技术

整合子是一个能够通过自身编码的整合酶来获取胞外游离基因或基因片段并使之表达的遗传元件系统。基因盒是能够被整合酶整合到整合子上或从整合子上切除的移动元件。基因盒一般包括2个功能性成分，即一个占该序列绝大部分的基因盒另一个位于其下游的重组位点，其功能绝大多数是抗生素抗性基因，少数的是编码产物功能不甚清楚的ORF。整合子-基因盒系统在细菌抗生素抗性的获得、细菌基因组进化方面可能发挥着重要作用。

大量证据表明细菌整合子在细菌中呈逐年递增趋势，同时在很大一定程度上反映了水产养殖环境中抗生素抗性基因的流动的风险。所以监测基因盒的动态变化是非常迫切的。

但是要实现水产养殖环境的全方位的监测，对于通量要求比较高。并且由于开放的水产养殖环境的核酸提取量比较少，所以迫切需要一种技术及能高通量的监测，又对样本的总量要求比较低的一种技术和方法。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供了一种基于高通量水产养殖环境中基因盒的定量检测方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种基于高通量水产养殖环境中基因盒的定量检测方法，包括水产养殖环境样本的采集，处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理，其特征在于，

所述基因盒包括整合子、磺胺类抗生素抗性基因、β-内酰胺类抗生素抗性基因、氯霉素类抗生素抗性基因；

所述整合子包括int1、int2两个基因；

所述磺胺类抗生素抗性基因包括sul1、sul2、sul3三个基因；

所述β-内酰胺类抗生素抗性基因包括blaTEM、blaSHV、blaPSE-1三个基因；

所述氯霉素类抗生素抗性基因包括floR、cmlA两个基因；

所述基因盒包含10个基因；

所述水产养殖环境样本包括水体、沉积物和水产品排泄物；

所述水产环境样本的处理具体包括如下：

水体样本通过0.22-0.28μm混合滤膜过滤，然后将混合滤膜冷冻保存；

沉积物直接采集，然后冷冻保存；

水产品排泄物是采集水产品的肠道，然后冷冻保存；

所述高通量qPCR检测的平台为wafergen平台的smartchip qPCR仪，所述smartchip qPCR仪一次可运行5184个qPCR反应，有14种引物和样本搭配模式；所述定量检测方法为qPCR法；所述定量检测方法的100nL反应体系为：

1×LightCycler 480SYBR Green IMaster

500nM each primer

DNA template 2ng/μL