[发明专利]一种通过多基因编辑获得高抗白粉病黄瓜种质材料的方法

权利要求书

1.一种提高黄瓜白粉病抗性的方法，其特征在于，使CsMLO1、CsMLO8及CsMLO11基因中的两个或三个共同产生突变；

或

使CsMLO1基因、CsMLO8基因及CsMLO11基因编码的氨基酸中的两个或三个共同产生突变来提高黄瓜白粉病的抗性；

所述CsMLO1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述CsMLO8的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述CsMLO11的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的提高黄瓜白粉病抗性的方法，其特征在于，所述CsMLO1基因发生的突变在CsMLO1靶点片段区域中，所述CsMLO1靶点片段序列为SEQ ID NO.4所示，所述CsMLO8基因发生的突变在CsMLO8靶点片段区域中，所述CsMLO8靶点片段序列为SEQ IDNO.5所示，所述CsMLO11基因发生的突变在CsMLO11靶点片段区域中，所述CsMLO11靶点片段序列为SEQ ID NO.6所示。

3.一种调控黄瓜白粉病抗性的重组载体，其特征在于，所述调控黄瓜白粉病抗性的重组载体包括选自所述CsMLO1基因的所述CsMLO1靶点片段，序列如SEQ ID NO.4所示，选自所述CsMLO8基因的CsMLO8靶点片段，序列如SEQ ID NO.5所示，选自所述CsMLO11基因的CsMLO11靶点片段，序列如SEQ ID NO.6及骨架载体质粒，所述CsMLO1靶点片段、所述CsMLO8靶点片段及所述CsMLO11靶点片段连接在所述骨架载体质粒上。

4.根据权利要求3所述的调控黄瓜白粉病抗性的重组载体，其特征在于，所述CsMLO1靶点片段、所述CsMLO8靶点片段及所述CsMLO11靶点片段之间通过依次连接的gRNA scaffold及tRNA进行间隔串联，所述gRNA scaffold的序列为：

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC；

所述tRNA的序列为：

AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGG TACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA。

5.一种制备权利要求3所述的调控黄瓜白粉病抗性的重组载体的方法，其特征在于，所述制备调控黄瓜白粉病抗性的重组载体的方法包括：将扩增引物扩增出含所述CsMLO1靶点片段的基因片段、含所述CsMLO8靶点片段的基因片段及含所述CsMLO11靶点片段的基因片段，然后各基因片段与线性化的载体质粒连接后，转入大肠杆菌，经过抽提后得到所述调控黄瓜白粉病抗性的重组载体。

6.根据权利要求5所述的制备调控黄瓜白粉病抗性的重组载体的方法，其特征在于，所述制备调控黄瓜白粉病抗性的重组载体的方法还包括利用引物扩增载体连接片段。

7.根据权利要求6所述的制备调控黄瓜白粉病抗性的重组载体的方法，其特征在于，扩增含所述CsMLO11靶点片段的基因片段的CsMLO11-F引物序列如SEQ ID NO.7所示；扩增出含所述CsMLO1靶点片段的基因片段的上游引物CsMLO1-R序列如SEQ ID NO.8所示，扩增出含所述CsMLO1靶点片段的基因片段的下游引物CsMLO1-F序列如SEQ ID NO.9所示；扩增出含所述CsMLO8靶点片段的基因片段的上游引物CsMLO8-R序列如SEQ ID NO.10所示，扩增出含所述CsMLO8靶点片段的的基因片段的下游引物CsMLO8-F序列如SEQ ID NO.11所示，扩增载体连接片段的VECTOR-R引物如SEQ ID NO.12所示。

8.根据权利要求6所述的制备调控黄瓜白粉病抗性的重组载体的方法，其特征在于，所述CsMLO11-F引物与所述CsMLO1-R引物为第一引物对，所述CsMLO1-F引物与CsMLO8-R引物为第二引物对，所述CsMLO8-F引物与VECTOR-R为第三引物对，分别进行扩增。