[发明专利]一种通过多基因编辑获得高抗白粉病黄瓜种质材料的方法

说明书

本发明提供一种通过多基因编辑获得高抗白粉病黄瓜种质材料的方法，使CsMLO1、CsMLO8及CsMLO11基因产生双突变或三突变或使CsMLO1基因、CsMLO8基因及CsMLO11基因编码的氨基酸共同产生双突变或三突变来提高黄瓜白粉病的抗性；与现有技术相比，本发明采用CsMLO1基因、CsMLO8基因及CsMLO11基因共同调控黄瓜白粉病抗性，可获得白粉病完全抗性材料；与现有技术相比，本发明采用CRISPR/Cas9多基因编辑技术实现CsMLO1基因、CsMLO8基因及CsMLO11基因的共同突变，所获得的种质材料为不含外源转基因片段的无转基因痕迹突变体材料，转基因安全性风险更小。

技术领域

本发明属于生物技术和分子生物学领域，具体涉及通过多基因编辑获得高抗白粉病黄瓜种质材料的方法以及相关黄瓜白粉病隐性抗病蛋白及其编码基因的应用。

背景技术

黄瓜白粉病是一种专性寄生的真菌性病害。近年来，在设施栽培条件下，作物种植密度增高、氮肥施用量增大、高温高湿的环境使白粉病造成的危害日益严重，严重影响了黄瓜的品质和产量。目前黄瓜白粉病的防治依然主要依靠使用化学农药，容易造成农药残留和生态环境污染。随着人们对食品安全和环境保护要求的提高，抗病品种培育成为防治白粉病的首选方法。然而黄瓜白粉病抗性是由多基因位点控制的数量性状，传统育种很难在不引入连锁累赘的情况下有效整合多个抗病基因，因此市面上普遍缺乏优良的抗性品种。为此通过生物学的方法提高黄瓜对白粉病的抗性是今后防治白粉病的有效策略之一。目前黄瓜白粉病抗性基因资源相对匮乏，函需发掘黄瓜抗病基因资源。克隆到新的抗病基因，利用CRISPR/Cas9多基因编辑技术和转基因的方法同时定点敲除多个隐性抗病基因，具有重要的经济意义。

MLO基因最早在大麦中发现，此基因的突变可以使大麦产生持久、广谱、高效的白粉病抗性。mlo隐性突变介导的白粉病抗性随后被广泛应用于其它多种作物的抗病育种中(Kusch and Panstruga,2017)。MLO基因家族成员之间存在功能冗余性，且不同成员突变对白粉病抗性的贡献率不相同，有主效和微效抗病基因之分。在双子叶植物中MLO基因第V分支成员参与介导白粉病抗性(Kusch and Panstruga,2017；Zheng et al.,2016)。黄瓜全基因组范围内CsMLO家族成员共13个，分为5个进化分支，其中第V分支包括三个基因CsMLO1、CsMLO8和CsMLO11(Schouten et al.,2014)。其中CsMLO8定位在白粉病主效QTL位点pm5.1区间内(Berg et al.,2015；Nie et al.,2015a)，研究发现在抗病材料中由于转座子插入导致该基因失活突变(Nie et al.,2015b)。利用重测序数据分析发现，CsMLO8功能缺失突变在多个白粉病抗性种质中普遍存在，且异源表达CsMLO8可以恢复番茄mlo突变体的感病性，这些证据表明CsMLO8是pm5.1位点的白粉病隐性抗病基因(Berg et al.,2015；Nie etal.,2015b)。然而CsMLO8失活仅产生下胚轴对白粉病的完全抗性，叶片仅为部分抗性(Berget al.,2015)。

虽然利用传统的杂交方法可以获得多基因突变体，但是构建三个以上的多突变或整合遗传距离较近的多基因突变，其筛选工作量非常庞大，而且容易因连锁累赘而引入不良性状。CRISPR/Cas9多基因编辑技术，通过在载体上装载Cas9元件和多个sgRNA元件，可以实现同时对多个基因定向编辑，对于整合多个基因位点进行分子育种具有重要的意义。另外，在完成靶位点编辑后，通过自交或与野生型杂交可以将Cas9等转基因载体元件剔除，从而得到不含外源片段插入的无转基因痕迹突变体材料。这种经基因修饰的材料与传统的转基因材料不同，只是修饰了物种自身的基因，不引入其他外源基因，转基因安全风险性较小。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供黄瓜白粉病隐性抗病相关蛋白及其编码基因与应用。

具体技术方案如下：

一种提高黄瓜白粉病抗性的方法，其不同之处在于，使CsMLO1、CsMLO8及CsMLO11基因中的两个或三个共同产生突变；