[发明专利]一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用

说明书

本发明提供了一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用，属于生物工程技术领域。本发明对来源于嗜热假诺卡氏菌腈水合酶做了改造，分别是对野生型对β亚基上的46号位，α亚基上的6、126号位进行了突变，构建得到的突变体比酶活显著提升，可较野生型提升1‑5倍。且底物谱也得到拓宽，对于异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2‑氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈等均有很好的催化作用，并且对相应底物的催化性能也显著提升。使得到的腈水合酶突变体能适用于更多的生产场景，并提高生产效率。

技术领域

本发明涉及一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合反应转化为高附加值酰胺类化合物的金属酶，在大宗化学品丙烯酰胺的工业生产上已经被广泛应用。目前，腈水合酶以其绿色环保、反应条件较温和、安全系数高等优势，而逐渐替代传统的化学法，使得酰胺类的生产符合可持续发展和绿色生产理念。

腈水合酶通常由α和β两个亚基构成，研究发现，目前已报道的原核生物来源的腈水合酶大都存在稳定性差、催化活性低、催化底物谱窄的问题。也有很多研究尝试对其进行了改造，来提高其相关的性质。但是目前的催化效率不高、底物谱窄等问题仍然限制着腈水合酶进一步的开发和应用。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明通过对来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)的腈水合酶的氨基酸改造，以期能拓宽底物谱并提升催化性能。

本发明提供了一种腈水合酶突变体，所述腈水合酶包含α亚基和β亚基；所述突变体是将腈水合酶亲本的α亚基的第6和/或126位突变，和/或β亚基的第46位突变；所述腈水合酶亲本的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体包括如下(a)-(f)任一：

(a)将β亚基的第46位突变为K，得到突变体M46K；

(b)将α亚基的第6位突变为T，得到突变体L6T；

(c)将α亚基的第126位突变为Y，得到突变体F126Y；

(d)将α亚基的第126位突变为Y，并将β亚基的第46位突变为K；

(e)将α亚基的第6位突变为T，并将β亚基的第46位突变为K；

(f)将α亚基的第6位突变为T、第126位突变为Y，并将β亚基的第46位突变为K。

本发明提供了编码所述突变体的基因。

本发明提供了携带所述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，以pET-24a(+)为表达载体。

本发明提供了表达所述突变体，或含有所述基因的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞包含原核或真核微生物。

在本发明的一种实施方式中，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。

本发明提供了一种生产酰胺类物质的方法，所述方法是以腈类物质为底物，利用所述突变体催化生成酰胺类物质。

在本发明的一种实施方式中，所述腈类物质包括异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈。

在本发明的一种实施方式中，所述酰胺类物质包括异丁酰胺、戊酰胺、丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺、萘甲酰、苯甲酰胺和肉桂酰胺。