[发明专利]一种用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒，其特征在于，包括引物群、PCR反应液、DNA聚合酶、FMR1基因前突变对照品、FMR1基因正常型对照品、ROX标记和去离子水；

所述引物群包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为CGGCGGCGGCGGCGAA，如SEQID NO:1所示，所述下游引物序列为ACCAGCTCCTCCATCTTCTCTTCAG，如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物R的5’端标有荧光探针；

所述ROX标记由20条大小不同的DNA片段组成：小于100bp，1条；100bp-200bp，4条；201bp-300bp，2条；301bp-400bp，3条；401bp-500bp，2条；501bp-600bp，3条；601bp-700bp，1条；701bp-800bp，2条；901bp-1100bp，2条；所述ROX标记中的全部序列的GC含量均在80%以上；

所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

（1）提取人细胞基因组DNA，进行紫外分光定量，OD₂₆₀nm/OD₂₈₀nm的比值应在于1.8-2.0之间；OD₂₆₀nm/OD₂₃₀nm的比值应大于2.0，使用去离子水将基因组DNA浓度稀释为15-50ng/μL，然后在每个PCR管中放2μL；

（2）将FMR1基因正常型对照品和FMR1基因前突变对照品各取2μL，加入到并列的PCR管中；

（3）PCR扩增：将受检DNA样本、FMR1基因全突变对照品和FMR1基因正常型对照品和所述引物群、DNA聚合酶、PCR反应液混合形成PCR反应体系，PCR反应中引物终浓度为750nM，总反应体系为15μL，反应体系组成如下：

PCR缓冲液 11.45μL，

引物 3.0μL，

DNA聚合酶 0.05μL，

样本DNA、FMR1基因前突变对照品或FMR1基因正常型对照品，1.0μL；

PCR反应在常规PCR仪上即可进行，扩增程序为：

98℃，5分钟，循环1次；

97℃，35秒，60℃，35秒，68℃，4分钟，循环30次；

72℃，10分钟，循环1次；

4℃，恒定，循环1次；

（4）片段分析：将PCR产物和ROX标记、HiDi甲酰胺按如下比例混合，并使用毛细管电泳仪进行分析：Hi-Di甲酰胺 10μL，ROX标记1μL，PCR产物，3μL；

（5）根据基因分析仪的片段分析结果，选取信号值最高的峰作为分析对象，系统会自动记录分析对象的分子大小，标记为Peak_i，将Peak_i代入以下公式进行计算，得出CGG_i的值，理论上，c₀取值83.2，m₀取值2.92，

，

式中，CGG_i为AGG之后的CGG序列重复数，由于AGG一般出现于CGG序列5‘端第9-10位，当“CGG_i +10”大于较短的CGG总长度时，该AGG位于较长的前突变序列中，反之则位于较短的野生型CGG序列上。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括：Tris盐酸、DMSO、甜菜碱、GC-melt、氯化镁、UNG酶及dNTPs。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述FMR1基因前突变对照品包括一段长度等于100个CGG重复的DNA序列；所述FMR1基因正常型对照品包括一段长度等于30个CGG重复的DNA序列。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述去离子水为经过高温灭菌的去离子水。