[发明专利]一种用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了一种用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括引物群、PCR反应液、针对CGG序列的高效DNA聚合酶、FMR1基因前突变对照品、FMR1基因灰区对照品、FMR1基因正常型对照品、ROX标记和去离子水。本发明所述的试剂盒可用于高效地扩增FMR1基因5’端的CGG重复序列，并利用毛细管电泳仪对CGG重复序列中AGG数目的数量和位置进行准确判读；可以用于快速准确地查出FMR1前突变携带者CGG序列中的AGG插入的位置，更加客观而且准确地对FMR1基因前突变携带者的生育风险进行评估。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体来说，涉及一种用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒及其使用方法。

背景技术

脆性X综合征(OMIM#30955)是发病率仅次于唐氏综合征的第二大导致智力障碍的疾病，同时也是最常见的导致男性智力障碍的遗传病。位于X染色体长臂的脆性X智力低下1号基因(Fragile X Mental Retardation 1，FMR1)5’端非编码区存在着一段以CGG为单位的三联核苷酸重复序列。随着CGG重复次数的增加，患者可能表现出一系列的临床症状。按照临床症状和发病风险，美国医学与遗传学会(American College of Medical Geneticsand Genomics，ACMG)将CGG重复序列分为四个等级：1，6-44之间被称为非受累型；2，45-54之间称为中间型或灰区；3，55-200之间称为前突变型；4，大于200时被称为全突变型。当CGG重复数扩增至200以上时，FMR1基因5’端的CGG序列和基因上游的CpG岛被超甲基化修饰，从而导致基因转录被沉默。FMR1编码的蛋白FMRP是一类RNA绑定蛋白，在神经元细胞中作为一种通用型的调节因子，对神经突触的形成有重要作用。因此全突变者在临床上表现出重度的智力障碍和发育迟缓，常常伴随有自闭症的倾向，也被称为脆性X综合征(Fragile XSyndrome，FXS)。

FMR1基因的前突变携带者一般没有重度智力障碍的表现，但由于该基因在RNA转录和蛋白质翻译过程中起到关键的调控作用，前突变FMR1基因被认为与一系列脆性X相关的临床症状有关，包括脆性X综合征、脆性X相关的原发性卵巢功能不全(Fragile Xassociated primary ovarian insufficiency，FXPOI)、脆性X相关的共济失调(Fragile Xassociated tremor and ataxia syndrome，FXTAS)。

Tan H 2009年在《神经科学快报》中提出FMR1基因的5’端非编码区存在一段CGG重复序列，其长度与特定临床症状相关。如图1所示，当CGG重复数在55以下时(图1左侧)基因可以正常表达；当CGG重复数位于前突变区间内时(图1中部)，蛋白表达量减少促使转录量的激增，高水平的mRNA导致FXTAS/FXPOI；当CGG重复数大于200时，超甲基化引发基因沉默，患者表现出重度的智力障碍，也就是脆性X综合征。

另外，前突变型的FMR1基因在传代过程中表现出高度的不稳定。在母系遗传(maternal inheritance)中，前突变型FMR1基因的CGG序列有明显的扩增倾向，导致后代体内的CGG重复数有可能扩增至200以上，发展为全突变型(即脆性X综合征患者)。因此，针对女性前突变携带者，亟需一种能够客观、准确评估其生育风险的方法。

现有研究表明，CGG序列的扩增模式主要由三个因素决定：携带者性别、CGG长度和AGG的数量。男性携带者的CGG序列一般不出现大幅度的扩增；在女性携带者中，CGG序列的长度和扩增至全突变的风险成正比，目前观测到的在一代之内扩增至全突变的最短序列为56；除性别和长度之外，CGG序列中AGG的数量对稳定CGG序列起到了重要作用。在一般人群的CGG序列中，从5‘端开始每隔9-11个CGG会出现一个AGG，将CGG序列隔断。在野生型的FMR1基因中AGG的数量一般为2-3个，而在前突变的CGG序列中AGG的数量一般为0-2个。AGG的缺失被认为是CGG序列发生动态扩增的重要原因。