[发明专利]非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重荧光PCR检测试剂盒及使用方法

权利要求书

1.非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重LyGreen荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包含核酸释放剂、反应预混液Premix Taq、荧光染料LyGreen、阴性对照、阳性对照以及引物混合液，引物混合液中，引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重LyGreen荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为用于非洲猪瘟病毒扩增的引物组，SEQ ID NO.1为上游引物，基因序列为CCAAAGGGCTCCTCCACT；SEQ ID NO.2为下游引物，基因序列为ATGGCATCTATCAGGTTCACTC。

3.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重LyGreen荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为用于猪传染性胸膜放线杆菌扩增的引物组，SEQ ID NO.3为上游引物，基因序列为CCGTAGGATTGCGGGTAA；SEQ ID NO.4为下游引物，基因序列为ATCCGAACCACTAACAGACA。

4.如权利要求1～3任一项所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重LyGreen荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物的浓度均为10pmol/μL，引物混合液中，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4的摩尔比为1:1:1:1。

5.如权利要求4所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重LyGreen荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，核酸释放剂通过以下方法制备得到：

以纯化水、浓HCl、Tris碱配制500mM/L的Tris-HCl溶液，加入NaCl，使NaCl浓度达到150mM/L，加入乙二胺四乙酸二钠，使乙二胺四乙酸二钠浓度达到3mM/L，加入2％(质量体积比)的十二烷基磺酸钠、加入0.5％(质量体积比)的十二烷基硫酸锂和1％(质量体积比)的甜菜碱，混匀，即可。

6.如权利要求1～3任一项所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重LyGreen荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，阳性对照为含有SEQ ID NO.5所示基因序列的pMD-MGF质粒和SEQ ID NO.6所示基因序列的pMD-apxⅣ质粒组成的混合质粒，阴性对照为无核酸酶水。

7.如权利要求6所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重LyGreen荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，pMD-MGF质粒与pMD-apxⅣ质粒的体积比为1:1。

8.如权利要求6所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重LyGreen荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO.5所示基因序列为非洲猪瘟病毒MGF基因序列，如下：

CCTTTTTGATAGAGGGAACACCGAAGCTACGTTGCTAACGCAACATCTCAAGAAGACAGCGGCCAAAGGGCTCCTCCACTTTGTGCTAGAAACGTTAAAATACGGCGGCAACATAGATACCGTCCTGACCCAAGCCGTAAAGTACAATCATAGAAAACTTTTAGATTATTTTCTGCGTCAACTACCTCGTAAACATATTGAAAAACTTTTGTTGCTGGCCGTGCAGGAAAAGGGCTTCTAAAAAAACATTGAACTTACTGTTGTCACATTTAAACTACTCCGTGAAACGCATCAAAAAACTACCGCGCTATGTGATAGAGTACGAGTCCACCTTGGTGATAAAGATTTTATTAAAAAAAAGAGTGAACCTGATAGATGCCATGTTGGAAAAGATGGT。