[发明专利]非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重荧光PCR检测试剂盒及使用方法

说明书

本发明提供了非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重荧光PCR检测试剂盒及使用方法，试剂盒包含核酸释放剂、反应预混液Premix Taq、荧光染料LyGreen、阴性对照、阳性对照以及引物混合液，引物混合液中，引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；在使用方法中，控制荧光PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性20s；55℃退火20s；72℃延伸20s；40个循环。使该试剂盒具有敏感性和特异性高的优点；可一次性完成对非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌检测，使检测过程更加简单、易于操作。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重荧光PCR检测试剂盒及使用方法。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swinefevervirus，ASFV)引起的一种传染病，家猪感染后发病率严重，死亡率高，目前尚无有效药物和疫苗防控，猪场一旦发病损失惨重，该病在世界范围广泛流行，给全球养猪业造成严重的经济损失。

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuroPneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actiuobacillus pleuropueumouiae，APP)引起的一种猪呼吸道传染病，各日龄猪均可感染，是导致育肥猪和种猪突然死亡的主要原因之一。猪场一旦感染APP，则很难净化，治疗难度较大，且该疾病常与其他疾病混合感染发生，给全球的养猪业造成了严重的经济损失。

非洲猪瘟和猪传染性胸膜肺炎均能引起肥猪口鼻出血、突然死亡，两者的症状相似，因此，在发生猪口鼻出血死亡大猪的情况时，容易产生恐慌，而由于非洲猪瘟具有强传染性，因此，不会对死亡猪进行剖检，导致死亡病因难以查出，进而导致补救措施难以正确实施。

染料法荧光PCR与Taqman探针法荧光PCR技术相比成本低，应用广泛，适用的PCR仪类型和范围广，结合熔解曲线分析，可区分不同PCR产物，可实现多种病原检测，是病毒核酸检测的重要方法，当前国内外均没有对非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌同时检测双重荧光PCR检测试剂盒，因此，本发明的研究对非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌的检测具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明提供了非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重荧光PCR检测试剂盒及使用方法，在该试剂盒中，使用了荧光染料LyGreen，引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1至SEQIDNO.4所示的特定序列；4条引物之间不干扰，使该试剂盒具有敏感性和特异性高的优点；荧光染料LyGreen的荧光信号更强、对PCR反应抑制性小、稳定好、耐冻融的优点，使该试剂盒具有适用性广、稳定性高的优点；使用该试剂盒，可一次性完成对非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌检测，使检测过程更加简单、易于操作。

本发明的技术方案如下：

非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重LyGreen荧光PCR检测试剂盒，包含核酸释放剂、反应预混液Premix Taq、荧光染料LyGreen、阴性对照、阳性对照以及引物混合液，引物混合液中，引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。

进一步的，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2为用于非洲猪瘟病毒扩增的引物组，SEQIDNO.1为上游引物，基因序列为CCAAAGGGCTCCTCCACT；SEQIDNO.2为下游引物，基因序列为ATGGCATCTATCAGGTTCACTC。

进一步的，SEQIDNO.3和SEQIDNO.4为用于猪传染性胸膜放线杆菌扩增的引物组，SEQIDNO.3为上游引物，基因序列为CCGTAGGATTGCGGGTAA；SEQIDNO.4为下游引物，基因序列为ATCCGAACCACTAACAGACA。