[发明专利]一种利用外周血细胞制备鼋染色体标本的方法

说明书

本发明公开了一种利用外周血细胞制备鼋染色体标本的方法，属于细胞遗传学领域。本发明通过采集鼋外周血，经过血细胞培养、秋水仙素处理、染色制片等步骤，制备得到了便于观察、图像清晰的鼋染色体中期分裂相标本。本发明克服了目前水生动物染色体标本制作方法中存在的对动物伤害大的问题，实现了无损伤取样，仅需采集样本的少量外周血，对动物的生存状态影响较小。本发明制片方法简单快速，采血后72h即可得到鼋染色体的中期分裂相，便于观察，为进一步开展鼋基因组及进化相关研究，实现鼋更充分的保护提供了有利的工具。

技术领域

本发明涉及细胞遗传学领域，特别是涉及一种利用外周血细胞制备鼋染色体标本的方法。

背景技术

染色体是细胞核的重要组分，是生物遗传信息的主要物质载体，生物的染色体组型不仅具有物种的特征，而且可以反映出生物进化的历史。染色体核型分析是水产遗传育种及种质鉴定工作中的重要研究内容。

目前在水产动物中常规的染色体的制备方法有三种，1)体内细胞培养法，即利用腹腔或胸腔注射植物血球凝集素(PHA-P)，刺激实验动物头肾或脾脏等造血器官内的B淋巴细胞大量增殖，然后利用秋水仙素进行处理，使细胞的分裂停留在中期，即可得到细胞中期染色体分裂相。2)胚胎细胞直接法，即利用正常发育的囊胚期或原肠胚早期胚胎，将细胞吹打分散后，加入秋水仙素进行处理，进而获得细胞中期染色体分裂相。3)体细胞直接法。即将动物幼体浸泡于一定浓度的秋水仙素中，使其旺盛分裂的鳃丝上皮细胞被阻抑在中期，该方法在鱼类中应用较多。

然而，上述方法在染色体制备中的问题在于，需要从实验动物中活体取材，样本取材后实验动物很难存活。因此，对于珍贵的实验素材或需要无损伤取样的保护动物而言，不具有适用性。

鼋(Pelochelys cantorii Gray，1864)，隶属于曲颈龟亚目(Cryptodira)鳖科(Trionychidae)鼋属(Pelochelys)，俗称癞头鼋，亚洲巨鳖，是自然分布于我国南方地区、东南亚和南亚次大陆的大型鳖科动物，成年个体背甲可达30～80cm，体重可达15～35kg。由于野生种群个体数目稀少，我国在上世纪80年代即将鼋列为了一级保护动物。21世纪初，鼋的濒危状态得到了相关国际组织的关注。2000年，鼋被国际自然保护联盟(IUCN)濒危物种红色名录列为濒危物种(EN)。2003年，鼋被列入濒临绝种野生动植物国际贸易公约(CITES)附录II。由于数目稀少，仅存的活体样本极为珍贵，传统的染色体标本制备方法在鼋中应用具有相当的难度。目前，鼋的染色体数目及核型对于动物保护者来说，仍是一个未知之谜。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用外周血细胞制备鼋染色体标本的方法，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种鼋染色体标本的方法，利用鼋外周血细胞制备鼋染色体标本。

优选的，包括以下步骤：

1)外周血取样：使用负压采血管和灭菌针头，从活体鼋的颈部血窦中采集外周血1ml；血液采集后，置于4℃条件下暂存；

2)外周血细胞培养:在无菌条件下进行细胞培养操作；在CO₂浓度为5％、28℃条件下培养72h；

3)秋水仙素处理：培养完成的血细胞加入终浓度为100～150ng/ml的秋水仙素处理3～4小时；

4)染色体制片：秋水仙素处理后，低渗50min；低渗后，用1500r/min的转速收集细胞，使用卡诺固定液固定1～2次，后采用冷玻片干燥法进行制片；使用吉姆萨染液染色20min。

优选的，所述负压采血管中含有肝素钠。