[发明专利]一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.采用限制性内切酶PacI对pFC332载体进行酶切，对酶切后的pFC332载体进行回收；

b.以 pG-F:CATCTAGAGGGCCGCTTAATGAGGACCGCTCGTCCCCTAT和PG-R:CTAGTAATGCGTAGAGGTGCGTCTGCCATGGTGATGGGAC 为引物，以埃德菌FS110基因组DNA为模板，扩增并回收得到pG启动子片段；

c.将pG启动子片段采用同源重组插入至酶切后的pFC332载体，菌液PCR和测序验证pG启动子的插入，构建得到pG-pFC332载体；

d.在所述的pG-pFC332载体的基础上，以P450基因的靶点序列5'-tcagttgatcgagaagatag-3'，设计并扩增5SrRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段，然后以5SrRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段为模板，进行融合PCR得到5SrRNA-P450-sgRNA片段；

e.用限制性内切酶PacI和BglII双酶切pG-pFC332载体、5SrRNA-P450-sgRNA片段，然后用T4 DNA连接酶将5SrRNA-P450-sgRNA片段连接至pG-pFC332载体中，连接产物转化至DH5α感受态细胞，Amp抗性筛选，扩增5SrRNA-P450-sgRNA片段进行验证，由此获得适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体；

所述的丝状真菌为拟盾壳霉FS482，所述的5SrRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的含靶点序列的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.按照权利要求1所述的构建方法构建得到的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体。

3.一种CRISPR/Cas9载体应用于拟盾壳霉FS482中P450基因敲除的方法，其特征在于，将权利要求2所述的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体通过原生质体转化法导入拟盾壳霉FS482原生质体中，对目标基因进行敲除。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以拟盾壳霉FS482基因组为模板扩增P450基因的上下游同源臂，然后进行融合PCR，得到含有P450基因的上下游同源臂的基因片段；通过PEG介导法将所述的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体和所述基因片段导入拟盾壳霉FS482原生质体，用潮霉素抗性PDA平板筛选阳性克隆，挑取克隆扩大培养提取基因组DNA验证重组载体的导入，并通过同源臂两端引物验证目标基因的敲除。